劉倩平 鄒三鵬 章志福

α-干擾素(IFN-α)能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，能夠增加NK細(xì)胞和其他一些活性免疫細(xì)胞功能，有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，其發(fā)揮抗腫瘤作用的機(jī)制是通過直接抑制腫瘤細(xì)胞的增殖與分化，目前IFN-α在臨床上已被廣泛用于血液系統(tǒng)腫瘤的治療［1］。Toll樣受體為介導(dǎo)天然免疫反應(yīng)并觸發(fā)或橋接適應(yīng)性免疫的模式識別的一類受體，這類受體在U937細(xì)胞中表達(dá)。作為Toll樣受體的主要外源性配體之一的內(nèi)毒素脂多糖(LPS)，可與Toll樣受體結(jié)合后通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的級聯(lián)效應(yīng)產(chǎn)生抑制U937的增殖［2］。本文旨在研究LPS在體外是否具有增強(qiáng)IFN-α抑制白血病細(xì)胞株U937細(xì)胞增殖效應(yīng)和機(jī)制。為TLR配體或其激動劑協(xié)同佐劑IFN-α免疫治療白血病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 胎牛血清(FBS)(天津市灝洋生物制品科技責(zé)任有限公司，批號:100413);二甲亞砜(DMSO)溶液、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)(北京SABC公司產(chǎn)品);EL301型酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek公司);人白血病細(xì)胞株U937細(xì)胞自購進(jìn)后復(fù)蘇使用。

1.2 方法

1.2.1 U937細(xì)胞增殖抑制率的測定 人白血病細(xì)胞株U937細(xì)胞常規(guī)離心棄上清復(fù)蘇，復(fù)蘇后的細(xì)胞在加熱滅活的10%FBS 及 100μg/ml鏈霉素、100 Μ/ml青霉素的 RPMI1640的培養(yǎng)基中，置于37℃、濕度飽和及5%的CO2孵箱中培養(yǎng)，平均每3天對培養(yǎng)基進(jìn)行更換并傳代一次。依據(jù)處理U937細(xì)胞的藥物不同對實驗進(jìn)行分組，實驗組:A組(單用IFN-α 0.1μg/ml)、B 組(單用 LPS 0.1μg/ml)，C 組(兩藥等劑量合用);另設(shè)空白對照組。經(jīng)藥物處理后的U937細(xì)胞，混勻后，移取100 μl至96孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞濃度約為5×105ml，每組重復(fù)8孔，最終每孔體積為0.2ml。置37℃、濕度飽和及5%的CO2孵箱中培養(yǎng);培養(yǎng)液3 d更換一次。于培養(yǎng)終止前4 h每孔中加入20 μL MTT(5 mg/ml)，4 h后離心(3000 rpm·min，5min)，將上清棄去，然后每孔加入DMSO 150 μL以終止培養(yǎng)。使用酶聯(lián)免疫檢測儀測定其吸光度，以此計算細(xì)胞增殖抑制率〔細(xì)胞增殖抑制率(%)=(l-實驗組吸光度/對照組吸光度)×100%〕。

1.2.2 U937細(xì)胞凋亡率的檢測 100 μL人白血病細(xì)胞株U937細(xì)胞置于含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，細(xì)胞密度調(diào)節(jié)至5×106/ml，Binding緩沖液洗滌一次，另取100 μL Binding緩沖液重懸，移取 5 μL AnnexinV-FITC 加入，置暗處孵育20min，移取10 μL濃度為1 mg/ml的AnnexinV/碘化丙錠，室溫下暗處孵育20min，Binding緩沖液洗滌后重懸，立即檢測，獲取參數(shù)并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)錄入Excel中初步處理后，采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

各組給予不同藥物與U937細(xì)胞作用2 d后，與對照組比較，各實驗組的抑制率(%)和凋亡率(%)均顯著升高(P＜0.05);實驗組組內(nèi)比較，兩藥等劑量合用較單用的抑制率(%)和凋亡率(%)亦均顯著升高(P＜0.05)。見表1。

表1 IFN-α和/或LPS對U937細(xì)胞增值的抑制率和細(xì)胞凋亡率的影響()

表1 IFN-α和/或LPS對U937細(xì)胞增值的抑制率和細(xì)胞凋亡率的影響()

注:*與對照組比，各實驗組均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);#C組分別比較A、B組有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)

組別 抑制率(%) 凋亡率(%)A組 0.41±0.05* 0.36±0.03*0.06±0.02 0.07±0.04實驗組 B組 0.33±0.01* 0.30±0.02*C組 0.72±0.06*# 0.63±0.05*#對照組

3 討論

急性白血病的發(fā)生和發(fā)展比較復(fù)雜，具有多階段、多步驟、多基因的特點(diǎn)。IFN-α抗腫瘤的活性較強(qiáng)，臨床上已廣泛應(yīng)用于惡性血液系統(tǒng)腫瘤治療并有較好療效［3］。其發(fā)揮抗腫瘤的效應(yīng)的主要機(jī)制是調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫活性或抑制腫瘤細(xì)胞的增殖［4］。LPS為革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要組成成分，其對應(yīng)的受體是Toll樣受體8，通過激動或抑制該受體在白血病細(xì)胞株U937的表達(dá)而達(dá)到干預(yù)的作用［5］。本實驗結(jié)果顯示，IFN-α或LPS對U937細(xì)胞的增殖率和凋亡率均有明顯的升高作用，而等劑量合用后這一作用顯著增強(qiáng)。為佐劑IFN-α聯(lián)合Toll樣受體配體或其激動劑免疫治療白血病提供了新的思路。

［1］熊芳，王興兵，張佳華，等.Toll樣受體在U937細(xì)胞的表達(dá)及其作用研究.中國實驗血液學(xué)雜志，2007，15(3):449-452.

［2］Huang B，Zhao J，Unkeless JC，et al.TLR signaling by tumor and immune cells:a double edged sword.Oncogene，2008，27(2):218-232.

［3］王曉桃，林文遠(yuǎn)，陳蓓莉，等.α-干擾素聯(lián)合脂多糖對白血病細(xì)胞株U937細(xì)胞周期的影響及其機(jī)制研究.中國全科醫(yī)學(xué)，2011，14(10 c):3457-3459.

［4］Lee WH，Liu FH，Lee YL，et al.Interferon-alpha induces the growth inhibition of human T-cell leukaemia line Jurkat through p38alpha and p38beta.J Biochem，2010，147(5):645-650.

［5］陳蓓莉，王曉桃，林文遠(yuǎn)，等.α-干擾素聯(lián)合脂多糖在體外抑制急性髓系白血病細(xì)胞株U937和HL60增殖的效應(yīng).重慶醫(yī)學(xué)，2010，39(23):3162-3164.