姚娜 芮紅兵

白喉毒素A鏈(DT-A)基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)可以產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用并殺死該細(xì)胞［1，2］。白喉毒素對(duì)于真核細(xì)胞來(lái)說(shuō)，其毒性是極其強(qiáng)烈的，但將DT-A基因與組織細(xì)胞特異性順式調(diào)控序列(啟動(dòng)子/增強(qiáng)子)連接，則該基因的表達(dá)只限定在該種特定細(xì)胞中，在其他細(xì)胞中將不表達(dá)。已有實(shí)驗(yàn)證明，在轉(zhuǎn)基因老鼠中導(dǎo)入由組織細(xì)胞特異性啟動(dòng)子控制的DT-A基因只能在特定細(xì)胞中表達(dá)，而對(duì)其他細(xì)胞無(wú)毒性作用，因此，白喉毒素基因組織特異性表達(dá)的特性可以應(yīng)用于惡性腫瘤的靶向治療［3，4］。免疫球蛋白啟動(dòng)子/增強(qiáng)子可以有效而特異性地控制其下游基因在產(chǎn)免疫球蛋白的B淋巴細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞中表達(dá)［5］。如將免疫球蛋白啟動(dòng)子/增強(qiáng)子與某些毒素基因相連，可以使該基因特異性地在產(chǎn)免疫球蛋白的細(xì)胞中表達(dá)，從而可將此毒素應(yīng)用于某些B淋巴系惡性腫瘤的治療。本研究探討了不同免疫球蛋白啟動(dòng)子控制的白喉毒素A鏈基因?qū)α馨土黾?xì)胞的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒與試劑 由鼠免疫球蛋白κ輕鏈啟動(dòng)子/增強(qiáng)子控制的白喉毒素A鏈真核表達(dá)載體pcDNA3IgκDTA、由鼠免疫球蛋白重鏈啟動(dòng)子/增強(qiáng)子控制的白喉毒素A鏈真核表達(dá)載體pcDNA3IgHDTA由本室構(gòu)建，同時(shí)構(gòu)建的還有含報(bào)告基因β半乳糖苷酶基因的真核表達(dá)載體 pcDNA3IgκLacZ、pcDNA3IgHLacZ。巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子控制的真核表達(dá)載體pcDNA3LacZ由蘇津自博士(福建省高血壓研究所)惠贈(zèng)。SP2/0-Ag14細(xì)胞(SP2)為鼠骨髓瘤細(xì)胞株，不產(chǎn)生也不分泌免疫球蛋白;CA46為人Burkitt's淋巴瘤細(xì)胞株，產(chǎn)生及分泌IgM免疫球蛋白及表面IgMκ輕鏈，K562為人白血病細(xì)胞株，該三種細(xì)胞株均購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)。培養(yǎng)條件:含10%滅活小牛血清的HDMEM培養(yǎng)液，37℃、5%CO2飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。Wizard DNA Clean-up System DNA純化試劑盒、細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒Cell-Titer 96? AQueousOne Solution Cell Proliferation Assay及脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒TransfastTMTransfection Reagent購(gòu)自Promega公司;培養(yǎng)基HDMEM購(gòu)自GIBCO公司。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)染及β半乳糖苷酶活性測(cè)定 質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)染由脂質(zhì)體(TransfastTMtransfection reagents，Promega)介導(dǎo)，同時(shí)轉(zhuǎn)染三種細(xì)胞。轉(zhuǎn)染方法按說(shuō)明書進(jìn)行:在0.5ml無(wú)血清的 HDMEM培養(yǎng)液中加入4μg質(zhì)粒 DNA、12 μl脂質(zhì)體，立即渦旋混勻以形成脂質(zhì)體/DNA混合體，再將脂質(zhì)體/DNA混合體加入培養(yǎng)于6孔培養(yǎng)板的1×106細(xì)胞中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中轉(zhuǎn)染1 h，再加入含10%小牛血清的完全培養(yǎng)基5ml，置37℃、5%CO2中培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，將細(xì)胞反復(fù)凍融三次獲得細(xì)胞提取液，然后按《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中的方法進(jìn)行β-半乳糖苷酶活性的檢測(cè)［6］。為了消除脂質(zhì)體在不同細(xì)胞中轉(zhuǎn)染率差異的影響，同時(shí)以質(zhì)粒pcDNA3LacZ轉(zhuǎn)染相同的細(xì)胞，以pcDNA3LacZ轉(zhuǎn)染細(xì)胞的β半乳糖苷酶活性為標(biāo)準(zhǔn)，目的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的β半乳糖苷酶相對(duì)活性為pcDNA3IgκLacZ/pcDNA3LacZ和pcDNA3IgHLacZ/pcDNA3LacZ。

1.2.2 不同免疫球蛋白啟動(dòng)子控制的白喉毒素A鏈基因?qū)Ζ?半乳糖苷酶活性的抑制 將質(zhì)粒 pcDNA3IgκDTA或pcDNA3IgHDTA與β-半乳糖苷酶基因進(jìn)行共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)染細(xì)胞為CA46細(xì)胞株，轉(zhuǎn)染方法仍由脂質(zhì)體(TransfastTMtransfection reagents，Promega)介導(dǎo)，轉(zhuǎn)染方法按說(shuō)明書進(jìn)行。質(zhì)粒DNA包含2μg質(zhì)粒 pcDNA3LacZ 及 2μg質(zhì)粒 pcDNA3IgκDTA 或pcDNA3IgHDTA，對(duì)照組以質(zhì)粒pcDNA3代替pcDNA3IgκDTA或pcDNA3IgHDTA。以共轉(zhuǎn)染CA46細(xì)胞后48 h瞬時(shí)表達(dá)的半乳糖苷酶活性的抑制程度來(lái)估測(cè)質(zhì)粒pcDNA3IgκDTA或pcDNA3IgHDTA在CA46細(xì)胞中DT-A的表達(dá)水平。

1.2.3 DT-A基因的表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用 按每孔2×105細(xì)胞在24孔板中接種CA46細(xì)胞，脂質(zhì)體介導(dǎo)含DT-A基因質(zhì)粒pcDNA3IgκDTA或pcDNA3IgHDTA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，同時(shí)以質(zhì)粒 pcDNA3IgκLacZ或 pcDNA3IgHLacZ作為對(duì)照，觀察DT-A基因的表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性作用。轉(zhuǎn)染后第1、3、5、7天由臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)計(jì)數(shù)活細(xì)胞并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，比較實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞存活情況。另外，細(xì)胞活力也通過(guò)試劑盒CellTiter 96?AQueousOne Solution Cell Proliferation Assay(Promega)以MTS法測(cè)定，方法按說(shuō)明書進(jìn)行，在轉(zhuǎn)染的96孔培養(yǎng)板細(xì)胞中按每孔20 μl加入MTS試劑，再繼續(xù)培養(yǎng)4 h，以酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)每孔的光密度值(OD490)，細(xì)胞活力以公式［(轉(zhuǎn)染的CA46細(xì)胞的OD490)/(未經(jīng)處理的CA46細(xì)胞的 OD490)×100］，以未經(jīng)處理的 CA46細(xì)胞的OD490值為標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 免疫球蛋白啟動(dòng)子/增強(qiáng)子在不同細(xì)胞中的活性 轉(zhuǎn)染后48 h，在產(chǎn)生及分泌IgM免疫球蛋白及表面IgMκ輕鏈的CA46細(xì)胞中，可檢測(cè)出較高水平的β半乳糖苷酶活性，相反，在非產(chǎn)免疫球蛋白的K562及SP2細(xì)胞中，難以檢測(cè)出β半乳糖苷酶活性。而pcDNA3LacZ轉(zhuǎn)染的3種細(xì)胞中均檢測(cè)出較高的β半乳糖苷酶活性(表1)。

2.2 β半乳糖苷酶基因的表達(dá)抑制 在CA46細(xì)胞中將質(zhì)粒pcDNA3IgκDTA或pcDNA3IgHDTA與β-半乳糖苷酶基因共轉(zhuǎn)染后進(jìn)行β半乳糖苷酶活性檢測(cè)。pcDNA3IgκDTA在CA46細(xì)胞中導(dǎo)致約80%的β半乳糖苷酶表達(dá)抑制，pcDNA3IgHDTA在CA46細(xì)胞中只導(dǎo)致約65%的β半乳糖苷酶表達(dá)抑制，表明在CA46細(xì)胞中質(zhì)粒pcDNA3IgκDTA較pcDNA3IgHDTA能表達(dá)更高的 DT-A水平(表2)，這說(shuō)明免疫球蛋白κ輕鏈啟動(dòng)子/增強(qiáng)子較免疫球蛋白重鏈啟動(dòng)子/增強(qiáng)子有更強(qiáng)的啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄活性。

表1 pcDNA3IgκLacZ及pcDNA3IgHLacZ在不同真核細(xì)胞中的表達(dá)(10-8 u/細(xì)胞)

表2 β半乳糖苷酶基因的表達(dá)抑制(10-8 u/細(xì)胞)

2.3 DT-A對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制 在轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA3IgκDTA或pcDNA3IgHDTA第1、3、5、7天進(jìn)行了細(xì)胞計(jì)數(shù)及細(xì)胞活力測(cè)定。如圖1所示，pcDNA3IgκDTA和pcDNA3IgHDTA的轉(zhuǎn)染導(dǎo)致 CA46細(xì)胞明顯的生長(zhǎng)抑制，與 pcDNA3IgκLacZ和pcDNA3IgHLacZ轉(zhuǎn)染的CA46細(xì)胞相比有明顯的差異(P＜0.05)。細(xì)胞抑制在轉(zhuǎn)染后第5天最明顯，大約25%的細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后死亡。同樣，MTS法檢測(cè)細(xì)胞活力表明，pcDNA3IgκDTA和pcDNA3IgHDTA轉(zhuǎn)染的CA46細(xì)胞活力明顯下降，pcDNA3IgκLacZ和 pcDNA3IgHLacZ轉(zhuǎn)染的 CA46細(xì)胞活力未見明顯變化(圖 2)。圖 1和圖 2均表明，與 pcDNA3IgHDTA相比，pcDNA3IgκDTA能更加明顯抑制 CA46細(xì)胞的生長(zhǎng)。

圖1 不同啟動(dòng)子控制的DTA基因?qū)A46細(xì)胞的抑制作用

圖2 pcDNA3IgκDTA及pcDNA3IgHDTA對(duì)CA46細(xì)胞活力的影響

3 討論

基因的組織細(xì)胞特異性表達(dá)及外源基因進(jìn)入靶細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的高效性是決定基因治療療效的兩個(gè)重要因素。本研究表明，由免疫球蛋白κ輕鏈(或重鏈)啟動(dòng)子/增強(qiáng)子調(diào)控的細(xì)菌β半乳糖苷酶基因能在產(chǎn)免疫球蛋白的細(xì)胞中特異性地表達(dá)，而難以在其他非產(chǎn)免疫球蛋白的細(xì)胞中檢測(cè)出其活性。另外，免疫球蛋白κ輕鏈(或重鏈)啟動(dòng)子/增強(qiáng)子調(diào)控的DT-A基因與β半乳糖苷酶基因共同轉(zhuǎn)染至產(chǎn)免疫球蛋白的CA46細(xì)胞中時(shí)，DT-A基因的表達(dá)能明顯抑制β半乳糖苷酶的表達(dá)活性。進(jìn)一步的結(jié)果表明，由免疫球蛋白κ輕鏈(或重鏈)啟動(dòng)子/增強(qiáng)子調(diào)控的DT-A基因能特異性地作用于產(chǎn)免疫球蛋白的惡性淋巴瘤細(xì)胞，導(dǎo)致CA46細(xì)胞明顯的生長(zhǎng)抑制;并且發(fā)現(xiàn)，免疫球蛋白κ輕鏈啟動(dòng)子/增強(qiáng)子較免疫球蛋白重鏈啟動(dòng)子/增強(qiáng)子有更強(qiáng)的啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄活性，由免疫球蛋白κ輕鏈啟動(dòng)子/增強(qiáng)子控制的基因能更有效的表達(dá)。SP2細(xì)胞雖然為骨髓瘤細(xì)胞，但因其不生產(chǎn)也不分泌免疫球蛋白，這樣免疫球蛋白κ輕鏈(或重鏈)啟動(dòng)子/增強(qiáng)子在這種細(xì)胞中也無(wú)活性。實(shí)事上，由組織細(xì)胞特異性啟動(dòng)子調(diào)控的DT-A基因已經(jīng)在許多惡性腫瘤細(xì)胞的治療實(shí)驗(yàn)中取得了滿意的效果［7-10］。

目前，雖然對(duì)于用何種基因治療的方法能最有效地清除腫瘤細(xì)胞尚無(wú)定論，但有一點(diǎn)很明確，即能直接清除腫瘤細(xì)胞的方法是最好的。腫瘤細(xì)胞自我更新的特性也說(shuō)明，對(duì)腫瘤的治療應(yīng)是盡可能地殺滅腫瘤細(xì)胞而不只是生物學(xué)上的修飾［11］。因此，在基因治療中最常用的目的基因是那些能直接殺死細(xì)胞的基因如腫瘤自殺基因及細(xì)菌毒素基因等。我們的研究表明由免疫球蛋白κ輕鏈(或重鏈)啟動(dòng)子/增強(qiáng)子控制的DT-A基因在體外有高度細(xì)胞特異性的外源性自殺基因特性。雖然免疫球蛋白κ輕鏈(或重鏈)同樣在正常B細(xì)胞中也有表達(dá)，但在腫瘤治療過(guò)程中如能正確區(qū)分正常與異常B細(xì)胞，那么由免疫球蛋白κ輕鏈(或重鏈)啟動(dòng)子/增強(qiáng)子調(diào)控的DT-A基因就可能用于B淋巴系惡性腫瘤的靶向治療。當(dāng)然，研究由惡性腫瘤細(xì)胞特異性順式調(diào)控序列控制的DT-A真核表達(dá)載體則可能達(dá)到真正意義上的惡性腫瘤靶向基因治療［7，10，12］。

許多實(shí)驗(yàn)表明DT-A基因可能用于惡性腫瘤的治療，但限制這種應(yīng)用的主要障礙之一在于當(dāng)前轉(zhuǎn)運(yùn)外源基因手段的低效率，這種低效率的轉(zhuǎn)染方法不能在體內(nèi)將目的基因?qū)胨械哪[瘤細(xì)胞。在本實(shí)驗(yàn)中，使用了脂質(zhì)體介導(dǎo)DT-A基因的轉(zhuǎn)染，脂質(zhì)體雖然具有能攜帶大片斷DNA、無(wú)免疫原性、相對(duì)病毒載體安全性好、能大批生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)［13］，但其轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞的效率較低而不能阻止所有腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，因?yàn)樵诒緦?shí)驗(yàn)中只有約25%的細(xì)胞被抑制。所以，在脂質(zhì)體用于體內(nèi)治療之前其轉(zhuǎn)染效率應(yīng)有較大程度的提高。另外，如將組織細(xì)胞特異性順式調(diào)控序列控制的DT-A基因與復(fù)制缺陷型腺病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒相結(jié)合，利用外源基因能在病毒基因組中忠實(shí)表達(dá)的特點(diǎn)，可能發(fā)展出一種高效體內(nèi)基因轉(zhuǎn)運(yùn)方法，更有利于DT-A基因的靶向治療。

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