王 剛，郭明珠，陳 光,*

枯草芽孢桿菌納豆激酶分離純化及酶學(xué)性質(zhì)

王 剛1，郭明珠2，陳 光1,*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130118；2.長春職業(yè)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130033)

利用30%～70%飽和度的硫酸銨沉淀，Sephadex G-50凝膠過濾層析對(duì)淺盤發(fā)酵納豆激酶進(jìn)行分離純化并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行初步研究。以纖維平板法測定納豆激酶活力，SDS-PAGE檢驗(yàn)純化效果。結(jié)果表明:純化后納豆激酶為電泳純，分子質(zhì)量約27.518kD，純化倍數(shù)和酶活回收率分別為19和42.1%，納豆激酶最適溫度為50℃，最適宜pH值為8.0。

納豆激酶；枯草芽孢桿菌；純化；酶學(xué)特性

心腦血管血栓是心腦血管的大病，全球每年腦血栓、腦梗塞、心肌梗塞、冠心病、動(dòng)脈硬化等心腦血管疾病奪走1200萬人的生命，接近世界總死亡人數(shù)的1/4，成為人類健康的頭號(hào)大敵。典型的以溶栓治療為目的的藥物包括尿激酶和組織型纖溶酶原激活物(TPA)。這些藥物存在價(jià)格昂貴，在體內(nèi)半衰期短等缺點(diǎn)。納豆激酶(nattokinase)是一種具有強(qiáng)烈溶栓作用的絲氨酸蛋白酶，來源于日本納豆[1-2]、海洋生物[3]、天培[4-5]、豆豉[6-7]等。納豆激酶具有易于提取，溶栓效果好，成本低廉，來源于食品，無任何毒副作用。近年來，各國學(xué)者對(duì)納豆激酶開展了廣泛的研究，包括菌種分離[8-9]，納豆激酶的發(fā)酵條件優(yōu)化[10-12]，分離提取[13]，功能及結(jié)構(gòu)分析[11-12,14-16]等。 Fujita等[17]的研究表明，與纖溶酶相比，納豆激酶對(duì)纖維蛋白本身更敏感，直接破壞交聯(lián)纖維蛋白，而不是破壞體內(nèi)的纖維蛋白原。更重要的是納豆激酶可以由消化道吸收到血液中而引起溶血栓作用[18]。因此，納豆激酶在溶栓藥物和保健食品開發(fā)方面，具有極其重要的意義，為獲得更好的溶栓、抗栓效果，實(shí)驗(yàn)以Sephadex G-50排阻層析對(duì)納豆粗提物進(jìn)行分離純化，以SDS-PAGE檢驗(yàn)純化效果，并進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)的初步研究，以期為納豆激酶保健品及納豆激酶抗栓制劑的研制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養(yǎng)基

納豆菌NK-1由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室提供；纖維蛋白原、標(biāo)準(zhǔn)尿激酶(1280U/支) 中國藥品生物制品檢定所；凝血酶(2000U/支) 浙江杭康海洋生物藥業(yè)公司；瓊脂糖(進(jìn)口分裝) 寶泰克生物制品有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

斜面培養(yǎng)基:蛋白胨0.5%、牛肉膏0.5%、氯化鈉0.5%、瓊脂2%、種子培養(yǎng)基:葡萄糖1%、蛋白胨1%、氯化鈉0.5%，調(diào)節(jié)pH＝7；淺盤發(fā)酵培養(yǎng)基:浸泡過夜大豆50g、麥芽糖0.1%、半乳糖0.1%、起始含水量50%。

1.2 儀器與設(shè)備

GD751分光光度計(jì) 上海雷韻試驗(yàn)儀器制造有限公司；Sartorius BS210S電子分析天平 德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；1-6p高速冷凍離心機(jī) 美國Sigma公司；CL-32L高壓蒸汽滅菌鍋 日本ALP公司；722紫外-可見分光光度計(jì) 山東高密彩虹分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 淺盤發(fā)酵及納豆激酶粗提液制備

將市售大豆清洗除雜，2.5～3倍的清水浸泡過夜，瀝去水分，121℃滅菌30min，降溫至50～60℃時(shí)，接入納豆菌，37℃恒溫靜置培養(yǎng)24h，4℃冰箱中后熟24h。用生理鹽水浸提納豆中的有效成分，經(jīng)過10000r/min冷凍離心，取上清，即為粗酶液。

1.3.2 納豆激酶活性測定方法

1.3.2.1 纖維蛋白平板制備

參照Astrup等[19]的方法，并進(jìn)行了一定的改進(jìn):稱取瓊脂糖0.5g，溶于4mL 0.01mol/L磷酸鹽緩沖液中，沸水浴煮沸，使其完全融化。設(shè)其為Q；另稱取纖維蛋白原11mg，溶于5mL 0.01mol/L磷酸鹽緩沖液中，45℃溫浴，設(shè)其為F；稱取凝血酶10U，溶于1mL 0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液中，45℃溫浴，設(shè)其為T。當(dāng)Q溫度降為50℃左右時(shí)，把Q倒入T中，然后倒入F，迅速混勻，防止氣泡的產(chǎn)生，倒平板。每平板打孔5～6個(gè)，點(diǎn)樣品，37℃培養(yǎng)16h。

1.3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在纖維蛋白平板上以打孔器打5個(gè)孔，每孔內(nèi)加入0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.5)10μL。將稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品尿激酶(1U/mL)依次加入5個(gè)孔中，體積分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μL，混勻，37℃保溫16～18h。用游標(biāo)卡尺測量每個(gè)溶菌圈的直徑，然后以溶菌圈面積(cm2)為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)尿激酶活力(U)為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)方程為y＝3.2782x(R2＝0.9641)。

1.3.2.3 納豆激酶活力

納豆中加入200mL生理鹽水浸提1h，3000r/min離心10min，取上清液，稀釋點(diǎn)樣于纖維蛋白平板，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出納豆激酶相對(duì)于尿激酶的活力。

1.3.3 硫酸銨鹽析

采用硫酸銨鹽析，取硫酸銨的飽和度分別為10%、 20%、30%、40%、50%、60%、70%，靜置過夜后，離心。分別測定上清和沉淀中的納豆激酶酶活力。

1.3.4 柱層析分離納豆激酶

采用葡聚糖凝膠Sephadex G-50對(duì)鹽析后的樣品進(jìn)行進(jìn)一步分離。柱層析的條件為:柱長:100cm；柱徑: 1cm；柱溫:室溫；上樣量:1mL；檢測波長:254nm；流速:0.5mL/min；洗脫液:pH8.0 10mmol/L Tris-HCl緩沖液(含2mmol/L CaCl2)。

1.3.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測

SDS-PAGE不連續(xù)凝膠電泳[20-21]。

1.3.6 蛋白質(zhì)含量測定

以Bradford法[22]測定蛋白含量，采用牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.3.7 pH值對(duì)納豆激酶活力的影響

將納豆激酶溶于各種不同梯度的pH值緩沖液中(pH4～7:檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液；pH8～11:廣泛緩沖液)，以纖維蛋白平板法測定酶活力，以最適條件下的酶活力(即最高值)為100%。

1.3.8 溫度對(duì)納豆激酶活力的影響

在不同溫度(25、30、37、40、45、50、55、60℃)條件下保溫16h，以纖維蛋白平板發(fā)測酶活力，以最適條件下的酶活力(即最高值)為100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 納豆激酶的分離純化

2.1.1 硫酸銨鹽析結(jié)果

圖1 硫酸銨飽和度對(duì)納豆激酶酶活力的影響Fig.1 Effect of degree of ammonium sulfate saturation on the precipitation of nattokinase

由圖1可知，隨著硫酸銨飽和度的不斷增加，納豆激酶逐漸的轉(zhuǎn)移到沉淀當(dāng)中。硫酸銨飽和度在0～30%時(shí)，納豆激酶大部分存在于上清液當(dāng)中，沉淀中的蛋白大部分為雜蛋白，可以除去，因此選擇去除雜蛋白的硫酸銨飽和度為30%。當(dāng)硫酸銨的飽和度為70%時(shí)，納豆激酶大部分轉(zhuǎn)移到沉淀中，硫酸銨飽和度繼續(xù)增加時(shí)，沉淀中納豆激酶酶活不再上升，因此，本實(shí)驗(yàn)中選擇沉淀納豆激酶的硫酸銨飽和度為70%。

2.1.2 Sephadex G-50柱層析分離納豆激酶

圖2 葡聚糖凝膠Sephadex G-50的分離圖譜Fig.2 Elution profile of Bacillus subtilis nattokinase on Sephadex G-50 column

由圖2可知，經(jīng)葡聚糖凝膠Sephedex G-50分離之后，得到4個(gè)吸收峰，其中吸收峰1和吸收峰3的濃度較大，吸收峰2和吸收峰4的濃度較小，其分離效果不很明顯。將4個(gè)組分收集并分別經(jīng)纖維蛋白平板法測納豆激酶酶活，吸收峰3為目的吸收峰。

2.1.3 納豆激酶分離結(jié)果的電泳檢測

葡聚糖凝膠層析分離后的組分，經(jīng)SDS-PAGE對(duì)目標(biāo)組分進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖3所示。

圖3 納豆激酶分離組分的電泳檢測Fig.3 SDS-PAGE of purified nattokinase

由圖3可知，經(jīng)過Sephadex G-50柱層析后的納豆激酶顯示為一條帶，表明分離效果較好。同時(shí)以已知標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)(1gMr)為縱坐標(biāo)，相對(duì)遷移率為橫坐標(biāo)繪圖，其回歸方程為y＝－1.055x＋5.2197 (R2＝0.9574)。按此方程計(jì)算，納豆激酶的分子質(zhì)量為27518D，與相關(guān)文獻(xiàn)[23-24]報(bào)道接近。

2.1.4 純化過程評(píng)價(jià)

表1 分離純化結(jié)果Table 1 Protein purity, total and specific kinase activity of isolate at different stages of purification

在純化納豆激酶的整個(gè)過程中，需要對(duì)每個(gè)步驟進(jìn)行測定評(píng)價(jià)，即對(duì)純化過程的每一步收集的酶液進(jìn)行有效(有活性)成分含量的測定，并計(jì)算酶比活力、總酶活力、純化倍數(shù)和回收率，結(jié)果如表1所示。純化過程中總蛋白、總酶活力呈逐漸降低的趨勢，但其酶比活力、純化倍數(shù)逐漸增高。經(jīng)Sephadex G-50層析后，純化倍數(shù)為19，回收率為42.1%。

2.2 納豆激酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

2.2.1 納豆激酶的最適反應(yīng)pH值

圖4 納豆激酶的最適pH值Fig.4 Effect of pH on the activity of Bacillus subtilis nattokinase

由圖4可知，隨著pH值的增加，納豆激酶活力呈先增加后降低的趨勢，當(dāng)pH值為4時(shí)，納豆激酶相對(duì)酶活力僅38%，當(dāng)pH值為8時(shí)，相對(duì)酶活力最高，pH7.0～9.0為最適反應(yīng)pH值。

2.2.2 納豆激酶的最適反應(yīng)溫度

圖5 溫度對(duì)納豆激酶活力的影響Fig.5 Effect of temperature on the activity of Bacillus subtilis nattokinase

由圖5可知，隨著溫度的升高，納豆激酶的相對(duì)酶活力，呈先增高后降低的趨勢，50℃時(shí)納豆激酶的相對(duì)酶活力最高；溫度降為室溫(25℃)時(shí)，納豆激酶的活力僅為30%。當(dāng)溫度大于50℃，納豆激酶的活力開始逐漸降低。

3 討 論

3.1 納豆激酶的分離純化

分離純化是一個(gè)復(fù)雜的過程，在純化過程中，隨著純化倍數(shù)的提高，酶活性逐漸降低，得率也逐漸下降，但酶比活力是逐漸升高的。采用離心、鹽析、Sephadex G-50凝膠色譜法對(duì)納豆激酶發(fā)酵的粗提物進(jìn)行純化，從發(fā)酵粗酶液到最后的Sephadex G-50柱層析，純化倍數(shù)為19倍，回收率為42.1%，全過程損失了57.9%，純化倍數(shù)與前人的研究[10,13,25-26]接近，略高于高大海等[27]的研究。

3.2 酶學(xué)性質(zhì)的研究

酶蛋白分子上帶有很多酸性和堿性氨基酸殘基，pH值的變化會(huì)直接影響到這些殘基側(cè)鏈基團(tuán)的解離狀態(tài)，進(jìn)而影響酶與底物的結(jié)合能力、催化反應(yīng)、酶的空間結(jié)構(gòu)及酶的活性。由于酶是蛋白質(zhì)，可隨溫度的升高而變性，因此酶促反應(yīng)應(yīng)有一個(gè)最適溫度，在此溫度下酶促反應(yīng)速度最快。納豆激酶的最適反應(yīng)溫度為50℃，與江曉等[28]的研究接近。與董志奎[24]、朱健輝等[29]的研究不同。最適反應(yīng)pH值為8.6，與慕娟[30]、鮑艷霞等[31]的研究接近。

4 結(jié) 論

4.1 納豆激酶純化工藝為:納豆激酶粗提液離心，30%飽和度硫酸銨去除雜蛋白，70%飽和度硫酸銨沉淀納豆激酶，沉淀用10mmol/L pH6.4磷酸緩沖液溶解后，經(jīng)Sephadex G-50凝膠層析，收集活性部分納豆激酶的純度很高，酶比活力為22388.81U/mg，SDS-PAGE電泳檢驗(yàn)為單一條帶。最終的純化倍數(shù)為19，酶活回收率為42.1%

4.2 納豆激酶最適反應(yīng)pH值為pH7.0～9.0，納豆激酶最適反應(yīng)溫度為45～55℃。

4.3 該純化工藝適于實(shí)驗(yàn)室高純度制備納豆激酶，以供進(jìn)一步研究其溶栓機(jī)理。

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Purification and Characterization of Bacillus subtilis Nattokinase

WANG Gang1，GUO Ming-zhu2，CHEN Guang1,*
(1. College of Life Science, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China；2. Changchun Vocational Institute of Technology, Changchun 130033, China)

In this study, nattokinase produced by Bacillus subtilis NK-1 after shallow tray fermentation was separated and purified by 30%－70% saturation ammonium sulfate precipitation and Sephadex G-50 column chromatography and enzymatically characterized. Nattokinase activity was measured by fibrin plate method, and SDS-PAGE was used to analyze its purity. Electrophoresis-pure nattokinase was obtained, with a molecular weight of about 27.518kD. The purification factor and activity recovery were 19 and 42.1%, respectively. The optimal reaction temperature and pH of this enzyme were 50 ℃ and 8.0, respectively.

nattokinase；Bacillus subtilis；purification；characterization

Q815

A

1002-6630(2012)15-0231-04

2011-06-28

吉林省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(201115189)；吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)青年啟動(dòng)基金項(xiàng)目(201129)

王剛(1978—)，男，講師，博士研究生，研究方向?yàn)槊腹こ獭-mail:gangziccc@163.com

*通信作者:陳光(1961—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)槊腹こ?。E-mail:chg61@163.com