敬海明，鄧 玉，成麗麗，趙 芯，劉玉杰，唐云明

韭菜過氧化物酶的分離純化及性質(zhì)

敬海明，鄧 玉，成麗麗，趙 芯，劉玉杰，唐云明*

(西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶市甘薯工程研究中心，三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，重慶 400715)

經(jīng)勻漿、抽提、硫酸銨分級沉淀、CM-Sepharose 離子交換層析、Superdex-200凝膠過濾層析，獲得電泳純的韭菜過氧化物酶(POD)。該酶比活力達到14031.41U/mg，純化倍數(shù)為102.96，回收率為10.85%。該酶分子質(zhì)量約為28.4kD，最適溫度40℃、最適pH值為4.6。該酶在20～40℃以及pH 4.0～8.0有較好的穩(wěn)定性，在最適條件下測得其Km值為18.15mmol/L。低濃度草酸、Zn2+、Mg2+等對該酶有較強激活作用；甲醇、乙醇、異丙醇、SDS、抗壞血酸(AsA)以及Mn2+、Fe3+等對該酶有較強的抑制作用。

韭菜；過氧化物酶；分離純化；性質(zhì)

過氧化物酶(peroxidase，POD)是一類以血紅素為輔基的氧化酶，在生物界中廣泛存在，主要催化H2O2和有機過氧化物對多種有機物和無機物的氧化作用[1]。作為一種抗氧化劑，參與了細胞木質(zhì)化，生長激素的氧化，次生物質(zhì)代謝、植物防衛(wèi)反應(yīng)等多種生理過程[2-4]，該酶現(xiàn)已廣泛的應(yīng)用于環(huán)保、食品工業(yè)、醫(yī)學(xué)診斷、生物傳感器等行業(yè)[5-8]。目前，該酶主要來源于辣根中，且國內(nèi)該酶大部分來源靠進口，因此尋找低成本來源的POD尤為重要。

韭菜(A. tuberosum Rott, ex Spr.)屬百合科多年草本植物，來源廣泛，四季均可取材，且又含有揮發(fā)油及硫化物，具有良好的藥用價值。故本實驗主要從韭菜中分離純化POD并研究其部分酶學(xué)性質(zhì)，以期為該酶的來源及進一步研究和韭菜的綜合開發(fā)利用提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

韭菜購自重慶市北碚區(qū)天生麗街永輝超市。

CM-Sepharose、Superdex-200、凝膠過濾層析分子質(zhì)量標準品、蛋白質(zhì)SDS-PAGE標準品 美國GE公司；丙烯酰胺和甲叉-雙丙烯酰胺 瑞士Fluka公司；其余試劑都為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

GL-21M高速冷凍離心機 湖南湘儀儀器有限公司；UV-2550型分光光度計 日本島津公司；AKTA primeplus蛋白質(zhì)純化系統(tǒng) 美國GE公司；冷凍干燥儀 德國Uni Equip公司；垂直板電泳槽、電泳儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 粗酶液的提取

新鮮韭菜，用雙蒸水清洗，擦干，稱質(zhì)量后剪碎，按1:2(m/V)的比例加入預(yù)冷的0.05mol/L pH7.2的磷酸鹽緩沖液，勻漿后4℃條件下靜置抽提2h；然后在4℃條件下10000r/min離心30min，取上清液；加入硫酸銨至35%飽和度，4℃靜置2h后，10000r/min離心20min，收集上清液；再加入硫酸銨至70%飽和度，4℃鹽析2h，10000r/min離心20min，取沉淀，用提取緩沖液將其全部溶解，在4℃條件下透析即得粗酶液[9]。

1.3.2 CM-Sepharose層析

經(jīng)0.05mol/L磷酸緩沖液(pH6.0)平衡層析柱后，上樣粗酶液10mL，用0～1mol/L的NaCl溶液(含0.05mol/L、pH6.0的磷酸緩沖液)進行線性梯度洗脫，流速0.5mL/min，每管收集5mL；測定各管酶活性和蛋白含量，收集活性較高的酶液，透析脫鹽，冷凍干燥后進行凝膠過濾。

1.3.3 Superdex-200層析

取上述酶液3mL上樣于Superdex-200層析柱，用提取緩沖液洗脫，流速0.3mL/min，每管收集3mL；測定每管酶活性和蛋白含量；收集活性較高的酶液，透析脫鹽冷凍干燥后，于－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 POD純度鑒定以及分子質(zhì)量測定[10]

采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行純度鑒定，12%分離膠、5%濃縮膠，加樣量10μL。經(jīng)SDS-PAGE和凝膠過濾層析測定其分子質(zhì)量。

1.3.5 蛋白質(zhì)含量的測定

采用紫外分光光度法和Bradford法(考馬斯亮藍染料法)測定[11]。

1.3.6 POD活性的測定

按照陳貽竹等[12]的方法進行。測定體系為3mL，其中含2.775mL 0.05mol/L 磷酸鹽緩沖液(pH7.0)、0.1mL 1% H2O2、0.1mL 4% 愈創(chuàng)木酚。加入0.025mL 酶液后開始反應(yīng)，在25℃條件下記錄470nm波長處2min內(nèi)光密度(OD)值的變化值。一個酶活力單位(U)定義為:在測定條件下每分鐘引起OD值改變0.01所需的酶量。

1.3.7 POD性質(zhì)的研究[9,13]

1.3.7.1 POD最適溫度和最適pH值

分別在不同溫度(20～70℃)和不同pH值(2.2、3.0、4.0、4.6、5.0、5.6、6.0、7.0、8.0)的條件下測定酶活力。二者均以最適條件下測得的酶活力作為100%，其余各條件下測得的酶活力分別與之相比即得相對酶活力。1.3.7.2POD熱穩(wěn)定性和pH值穩(wěn)定性

分別將酶液放置在不同溫度(20～60℃)和不同pH值(2.2、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)條件下，每隔1h測定該酶液的活力。溫度穩(wěn)定性以25℃的酶活力為100%，pH值穩(wěn)定性以pH 7.0 的酶活力為100%，其余溫度和pH值條件下測得的酶活力分別與之相比即得相對酶活力。

1.3.7.3 米氏常數(shù)(Km)的測定

在最適溫度和最適pH值條件下，以不同濃度的H2O2(0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mol/L)為底物，測定POD的活力，采用雙倒數(shù)作圖法(Lineweaver-Burk法)[10]求出該酶的Km值。

1.3.7.4 不同有機溶劑對POD活性的影響

分別將甲醇、乙醇、異丙醇這3種有機溶劑與緩沖液和酶液混合，混合后體積分數(shù)分別為10%、20%、30%、40%、50%，在25℃條件下作用30min，再測定POD活力，以不加有機溶劑時的酶活力為100%。

1.3.7.5 不同化合物對POD活性的影響

分別將NaCl、AsA、SDS、KSCN、尿素、草酸配成100mmol/L母液，再按一定比例分別與緩沖液和酶液混合，混合后終濃度分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mol/L，在25℃條件下作用30min，再測定POD活性，以不加化合物時的酶活力為100%。

1.3.7.6 不同金屬離子對POD活性的影響

分別將各種金屬離子配成100mmol/L母液，再按一定比例分別與緩沖液和酶液混合，混合后終濃度分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mol/L，在25℃條件下作用30min，再測定POD活力，以不加金屬離子時的酶活力為100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 韭菜POD的分離純化

粗酶液經(jīng)CM-Sepharose層析后，所得的結(jié)果如圖1所示，表明雜蛋白和POD達到了較好的分離效果，收集活性峰，透析冷凍干燥后經(jīng)Superdex-200層析，結(jié)果如圖2所示。酶的整個分離純化結(jié)果如表1所示，該酶的回收率較低，還需優(yōu)化實驗條件進一步提高其純度。

圖1 韭菜POD的CM-Sepharose離子交換層析Fig.1 Elution profile of POD from Chinese chives on CM-Sepharose column

圖2 韭菜POD的Superdex-200凝膠過濾層析Fig.2 Elution profile of POD from Chinese chives on Superdex-200 column

表1 韭菜過氧化物酶的純化Table 1 Summary of separation and purification of POD from Chinese chives

2.2 韭菜POD分子質(zhì)量

收集圖2活性峰，透析冷凍干燥后樣品經(jīng)SDSPAGE，顯示為單一條帶(圖3)，說明該POD樣品已達到電泳純。測得其亞基相對分子質(zhì)量約為28.4kD；通過Superdex-200凝膠過濾層析測得的全酶相對分子質(zhì)量約為29kD，由此基本上可斷定韭菜POD是由單一亞基組成，與大多數(shù)文獻報道相符[9,14-20]。

圖3 韭菜POD的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.3 SDS-PAGE of purified POD from Chinese chives

2.3 韭菜POD的部分理化性質(zhì)研究

2.3.1 韭菜POD最適溫度和熱穩(wěn)定性

由圖4可知，韭菜POD的最適反應(yīng)溫度為40℃。由圖5可知，在20～40℃韭菜POD有較好的熱穩(wěn)定性，保溫5h后剩余活力仍有輕微的激活作用，但在溫度超過50℃保溫1h后，酶活力喪失達60%以上，此后變化不大。

圖4 溫度對韭菜POD活力的影響Fig.4 Effect of temperature on the activity of POD from Chinese chives

圖5 韭菜POD的熱穩(wěn)定性Fig.5 Thermal stability of POD from Chinese chives

2.3.2 韭菜POD最適pH值和pH值穩(wěn)定性

圖6 pH值對韭菜POD活力的影響Fig.6 Effect of pH on the activity of POD from Chinese chives

圖7 韭菜POD的pH值穩(wěn)定性Fig.7 pH stability of POD from Chinese chives

由圖6可知，韭菜POD的最適反應(yīng)pH值為4.6。由圖7可知，在pH4.0～8.0的環(huán)境下，穩(wěn)定性較好，但pH值低于3.0及以下，放置1h后酶活力會喪失50%以上，隨后變化趨勢逐漸減緩。

2.3.3 韭菜POD米氏常數(shù)的測定

采用雙倒數(shù)作圖法(圖8)，在最適作用條件下，用韭菜POD催化不同濃度(0.01～0.05mol/L)的H2O2與愈創(chuàng)木酚反應(yīng)，測定POD活力，從而求得該酶的Km值為18.15mmol/L。

圖8 雙倒數(shù)法測韭菜POD的米氏常數(shù)Fig.8 Lineweaver-Burk plot for Km determination of POD from Chinese chives

2.3.4 不同有機溶劑對韭菜POD活性的影響

圖9 甲醇、乙醇、異丙醇對韭菜POD活力的影響Fig.9 Effects of methanol, ethanol and isopropyl alcohol on the activity of POD from Chinese chives

由圖9可知，甲醇、乙醇、異丙醇3種有機溶劑均對該酶有較強的抑制作用，隨著有機溶劑體積分數(shù)的增大，抑制作用越明顯，當體積分數(shù)達到30%時，甲醇抑制了該酶70%以上的活性，乙醇及異丙醇基本上完全抑制了該酶活性。

2.3.5 不同化合物對韭菜POD活性的影響

由圖10可知，不同化合物以及同一化合物的不同濃度對韭菜POD活性的影響存在著較大的差異。草酸對該酶的作用具有兩重性:低濃度時有明顯激活作用，但濃度超過0.01mol/L，則會明顯抑制相對酶活力，達到0.03mol/L時相對酶活力則完全被抑制；尿素、KSCN對該酶活力有輕微的抑制作用；而SDS、AsA對該酶活力具有很強的抑制作用，在0.01mol/L的AsA濃度下就可以完全抑制該酶活力。

圖10 不同化合物對韭菜POD活力的影響Fig.10 Effects of various compounds on the activity of POD from Chinese chives

2.3.6 不同金屬離子對韭菜POD活性的影響

圖11 不同金屬離子對韭菜POD活力的影響Fig.11 Effect of metal ions on activity of POD from Chinese chives

由圖11可知，Zn2+、Mg2+對該酶有很強的激活作用，說明這兩種離子有可能促進了該酶空間構(gòu)象的改變，從而提高了酶的催化活性；Ba2+、Ca2+、K+、Li+對該酶有輕微的激活作用；而Mn2+、Fe3+對該酶有明顯的抑制作用，在0.02mol/L的Fe3+濃度條件下就可以完全抑制酶活力。

3 討 論

本實驗通過一系列方式獲得的電泳純韭菜過氧化物酶，與其他材料來源的POD相比有以下特點:首先，取材方便，一年四季均可，價格相對又便宜；其次，使純化步驟簡便化，但仍獲得了較高的比活力，純化倍數(shù)和回收率。韭菜POD在20～40℃有較好的熱穩(wěn)定性，5h以內(nèi)溫度對酶活力還有輕微的激活作用，最適反應(yīng)溫度為40℃；pH值耐受范圍較廣，在pH4.0～8.0的環(huán)境下，5h以內(nèi)酶活變化不大，最適pH4.6。該酶的分子質(zhì)量約為28.4kD，Km值為18.15mmol/L，這些理化性質(zhì)與其他來源的POD差異比較如表2所示。說明不同種屬間的過氧化物酶在性質(zhì)上是有差異的，且這又與它們所處的生物體環(huán)境相適應(yīng)。

表2 不同來源的POD理化性質(zhì)間的比較Table 2 Physicochemical properties of POD of different origins

不同有機溶劑、化合物、金屬離子對POD活性均有一定影響，這是由POD的結(jié)構(gòu)特點決定的，Halpin等[21]研究表明，鐵離子是POD活性中心的必需成分，即POD是一種由單一肽鏈與卟啉構(gòu)成的血紅素蛋白, 脫輔基蛋白分子必須與血紅素結(jié)合才構(gòu)成全酶[4]。當隨著有機溶劑體積分數(shù)增大，酶活性越來越低，主要是因為酶在水溶液中，空間構(gòu)象的穩(wěn)定由氫鍵、疏水鍵、范德華力等維持，在酶分子表面形成了一個極性水化層，但有機溶劑的加入?yún)s破壞了該水化層，使溶液的極性降低了，從而導(dǎo)致了維持酶構(gòu)象的次級鍵遭到破壞，引起空間構(gòu)象的改變，讓酶活性中心的微環(huán)境變化導(dǎo)致酶活性的喪失。有機化合物草酸對該酶具有雙重性，原因可能是:在低濃度條件下，草酸的加入讓酶的構(gòu)象發(fā)生了一定改變，降低了酶活性，但這也使更多的該酶活性中心暴露了，從而使酶的結(jié)合部更加有利于結(jié)合底物，且后者的影響程度超過了前者，從而在整體上來說該酶的活性增高了，但在高濃度條件下，它又表現(xiàn)出了類似有機溶劑的特性，使該酶的空間構(gòu)象遭到了更大的破壞，從而不能維持酶活性中心的存在，進而引起酶活性的完全喪失，SDS、AsA對該酶活性有明顯的抑制作用，其中SDS是一種變性劑，能夠破壞蛋白質(zhì)分子中的疏水鍵和氫鍵，進而改變酶的空間構(gòu)象，導(dǎo)致酶活性降低，AsA會破壞含鐵血紅素亞基，從而破壞該酶構(gòu)成的完整性，引發(fā)酶失活，KSCN對該酶活性沒有明顯的影響，而甘薯葉[9]實驗中KSCN對其活性有明顯的作用；金屬離子Mn2+、Fe3+對該酶有明顯的抑制作用，Ca2+對該酶作用不明顯，而在甘薯葉[9]實驗中Ca2+活性對其活性有明顯抑制作用。

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Isolation, Purification and Characterization of Peroxidase from Chinese Chives

JING Hai-ming，DENG Yu，CHENG Li-li，ZHAO Xin，LIU Yu-jie，TANG Yun-ming*
(Key Laboratory of Eco-environments in Three Gorges Reservoir Region, Ministry of Education, Chongqing Sweet-potato Engineering Research Center, School of Life Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)

Electrophoresis-pure peroxidase (POD) from Chinese chives was obtained after sample homogenization, extraction, ammonium sulfate precipitation, CM-Sepharose chromatography and Superdex-200 gel filtration. The purified POD had an activity of 14031.41U/mg. The purification factor was 102.96 and the recovery rate was 10.85% . The molecular weight of this enzyme was 28.4 kD, the optimum temperature and pH were 40 ℃ and 4.6, respectively. The POD enzyme was stable under 20－40℃ and pH 4－8. The Kmof this enzyme was determined to be 18.15 mmol/L under optimum conditions. Its activity could be strongly activated by low concentrations of oxalic acid, Zn2+and Mg2+, but inhibited by methanol, ethanol, isopropanol, SDS, ascorbic acid, Mn2+and Fe3+.

Chinese chives；peroxidase；isolation and purification；characterization

Q554.6

A

1002-6630(2012)15-0226-05

2011-07-28

重慶市科委重點攻關(guān)項目(CSTC2011AB1027)

敬海明(1986—)，男，碩士研究生，主要從事蛋白質(zhì)與酶工程研究。E-mail:jinghming@163.com

*通信作者:唐云明(1960—)，男，教授，博士，主要從事蛋白質(zhì)與酶工程研究。E-mail:tbright@swu.edu.cn