楊永利，郭守軍，葉文斌，潘顯輝，林月娟，林海雄

銀合歡種子多糖微結(jié)構(gòu)的原子力顯微鏡觀察

楊永利1，郭守軍1，葉文斌2，潘顯輝2，林月娟3，林海雄1

(1.韓山師范學(xué)院生物系，廣東 潮州 521021；2.西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；3.汕頭大學(xué)分析測試中心，廣東 汕頭 515063)

目的:通過對銀合歡種子多糖的形貌觀察，研究其微結(jié)構(gòu)。方法:采用熱水浸提法提取銀合歡種子多糖，通過改變?nèi)芤旱馁|(zhì)量濃度、云母基底表面的化學(xué)修飾等不同制樣方式，用原子力顯微鏡(AFM)可視化不同樣品制備條件形成的聚集體和非聚集體銀合歡半乳甘露聚糖結(jié)構(gòu)形貌。結(jié)果:樣品在不同制備條件下得到膜狀、顆粒狀的聚集體結(jié)構(gòu)和非聚集體單糖分子結(jié)構(gòu)。結(jié)論:銀合歡種子多糖的單個糖分子呈線形螺旋狀，并具有短的分枝結(jié)構(gòu)，分子鏈間互相纏繞，而形成網(wǎng)格狀。

原子力顯微鏡； 銀合歡多糖； 微結(jié)構(gòu)

銀合歡(Leucaena glaucal (L. ) Benth)為豆科含羞草亞科銀合歡屬多年生灌木或喬木，原產(chǎn)美洲，現(xiàn)廣泛分布于世界熱帶亞熱帶地區(qū)，我省資源豐富。銀合歡種子胚乳富含多糖，主要成分是半乳甘露聚糖，其結(jié)構(gòu)是由β- D- 甘露糖通過α-1,4糖苷鍵連接形成主鏈，在某些甘露糖殘基上半乳糖通過 α-1,6糖苷鍵形成側(cè)鏈而構(gòu)成的多分枝聚糖。半乳甘露聚糖膠具有較好的水溶性和交聯(lián)性，在低濃度下能形成高黏度的穩(wěn)定性水溶液[1]，所以被作為增稠劑、穩(wěn)定劑、凝膠劑、黏合劑而廣泛應(yīng)用食品、醫(yī)藥、石油、紡織和造紙等領(lǐng)域。

我國對多糖的研究多限一級結(jié)構(gòu)的解析，有關(guān)立體結(jié)構(gòu)方面的研究剛剛起步。目前，對多糖二級結(jié)構(gòu)的研究存在許多困難[2]。由于多糖相對分子質(zhì)量較大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，難以得到良好的晶形，而且在水溶液的分散狀態(tài)下難以形成剛性的結(jié)構(gòu)，因此給多糖二級結(jié)構(gòu)乃至高級結(jié)構(gòu)的研究造成了很大的困難[3-5]。原子力顯微鏡(atomic force microscope，AFM)是在掃描隧道電子顯微鏡(scanning tunneling microscope，STM)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新穎的物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析方法。AFM的出現(xiàn)，使得對多糖這樣的生物大分子表面形貌的觀察成為可能[6-8]。AFM相對于電子顯微鏡(electronmicroscope，EM)和STM在生物大分子結(jié)構(gòu)研究中具有明顯優(yōu)勢，生物大分子樣品無需用重金屬包裹或制作金屬復(fù)制物，可以在空氣或各種溶劑體系中直接觀測，使得生物大分子樣品能在接近生理環(huán)境的條件下直接進(jìn)行研究，這是其他化學(xué)、物理分析方法所無法替代的。通過控制成像操作力的大小，采用合適的成像模式不引起樣品分子的漂移和損壞，圖像的可重復(fù)性大大提高；現(xiàn)場操作性好，能夠研究監(jiān)測整個生化反應(yīng)的動力學(xué)過程；載體的選擇更加簡單，范圍也更大，包括云母片、玻璃片、石墨、二氧化硅和某些生物膜等，但在生物大分子結(jié)構(gòu)研究中最常用的是新鮮解離的云母片，主要因?yàn)樵颇钙浅Ｆ秸胰菀滋幚韀4]。近年來對小核菌多糖[9]和植物多糖[3,10-11]等大分子鏈構(gòu)象的研究中，都用AFM觀察到了多糖的微觀結(jié)構(gòu)。

本實(shí)驗(yàn)通過不同的制樣方法，將多糖樣品分散在云母片上，采用輕敲模式，用AFM掃描多糖樣品，獲得了較清晰的銀合歡多糖的單分子鏈結(jié)構(gòu)影像及分子的聚集態(tài)，為進(jìn)一步半乳甘露聚糖的結(jié)構(gòu)，揭示多糖的構(gòu)效關(guān)系，提供了重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

銀合歡種子由云南省種苗總站提供。

無水乙醇、乙醚、丙酮 天津紅巖試劑廠；吐溫-80 廣州市裕祥化工有限公司；以上試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

MultiMode NanoscopⅢa原子力顯微鏡(配有Si3N4探針，微懸臂224μm，彈性系數(shù)20～70N/m) 美國Digital Instrument公司；LC-6A 高壓液相色譜儀(配有RI-10A示差折光檢測器、7725i手動進(jìn)樣器、 CTO-10AS柱溫箱、CBM-20A在線控制器和LC-solution 分析軟件) 日本島津公司；TSK-Gel SW3000和TSK-Gel SW4000色譜柱 日本Tosoh公司；UV-2800紫外-可見光分光光度計 尤尼卡上海儀器有限公司；HJ-6A六聯(lián)恒溫磁力攪拌器 江蘇金壇宏華儀器廠；ESJ120-4型號電子天平沈陽龍騰電子有限公司；LGJ-18型冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；9101型高速樣品粉粹機(jī) 北京檢測儀器有限公司；DL-5低速冷凍大容量離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 銀合歡種子多糖的提取

銀合歡種子熱水浸泡12h，研磨，手工剝離胚乳，丙酮脫水(2h)，真空干燥后粉粹。胚乳粉按料液比1:30 (m/V)分散于70℃熱水中(4h)，5000r/min離心10min，取上清液用Sevag法除蛋白。將提取液與 Sevag試劑(氯仿:正丁醇體積比4:1)按體積比5:1 混合，振蕩，離心棄去變性蛋白，重復(fù)4次。合并水層，用95%的乙醇沉淀(體積比3:1)，5000r/min離心10min，沉淀物溶于熱水中，攪拌狀態(tài)下慢慢加入斐林試劑，析出銅絡(luò)合物，靜置1h，傾出上清液，用水洗滌3 次，離心分離得絡(luò)合物，向絡(luò)合物中加4℃ 蒸餾水，再滴加0.5mol/L 的HCl 使之全部溶解，用95%的乙醇沉淀(體積比3:1)，離心，所得絮狀物分別用乙醇、丙酮、乙醚洗滌，冷凍干燥得潔白銀合歡種子多糖粉。并計算提取過程中銀合歡種子中胚乳含量、胚乳中多糖含量和種子多糖得率[12]。

1.3.2 銀合歡種子多糖的純度鑒定

1.3.2.1 紫外光譜的測定

將銀合歡種子多糖用純水分散后配制成質(zhì)量濃度為500μg/mL的溶液，用紫外-可見光分光光度計掃描，觀察波長260nm和280nm的吸收.

1.3.2.2 HPLC-GPC分析

精確稱取銀合歡種子多糖10mg于25mL燒杯中，純凈水溶解，0.45μm水性微孔濾膜過濾后定容至10mL，進(jìn)行HPLC-GPC分析。色譜條件:色譜柱TSK-Gel SW3000與SW 4000串聯(lián)，RI-10A 示差折光檢測器，流動相:H2O；流速:0.6mL/min；柱溫:25℃；進(jìn)樣體積:2 5μL。

1.3.3 AFM 樣品制備及觀察

稱取一定少量銀合歡種子多糖樣品用蒸餾水溶解于燒杯中，在70℃條件下恒溫攪拌2h，配制質(zhì)量濃度為0.1μg/mL與1μg/mL的稀釋液，冷卻，備用。

制備方法一:在新鮮解離的云母片表面上滴2mmol/L NiCl210μL，保持1～2min 后水洗，干燥，使云母表面帶正電；在處理過的云母表面，分別滴加5μg/mL和1μg/mL多糖溶液10μL，保持10min后用大量水沖水洗，干燥，備用。

制備方法二: 在1μg/mL與0.1μg/mL的稀釋液中加入一滴吐溫-80，攪拌30min，使其分散，冷卻，按“方法一”制樣。

AFM 觀察:輕敲模式(Tapping Mode) 下對樣品進(jìn)行AFM掃描觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 銀合歡種子多糖得率

經(jīng)實(shí)驗(yàn)測定，種子中胚乳含量為9%，胚乳中多糖含量為55.7%，種子中多糖得率為5%。

2.2 銀合歡種子多糖的純度

銀合歡種子多糖溶液的紫外光譜在260nm和280nm波長處未見蛋白質(zhì)和核酸的特征吸收。銀合歡種子多糖的HPLC-GPC色譜圖見圖1，只出現(xiàn)一個峰，保留時間為4.867min，所檢測到的峰沒有裂峰的出現(xiàn)，說明分離和純化的銀合歡種子多糖是由一種多糖組成的，面積歸一化計算純度為99.5%。

圖1 銀合歡種子多糖的HPLC-GPC色譜圖Fig. 1 HPLC profile of polysaccharides extracted from Leucaena glaucal seeds

2.3 銀合歡種子多糖的聚集態(tài)形貌及單分子形貌

2.3.1 云母表面形成的凝膠膜和顆粒狀形貌

圖2 質(zhì)量濃度為5μg/mL(a)和1μg/mL(b)銀合歡種子多糖的掃描圖象Fig.2 Scanned images of Leucaena glaucal seed polysaccharides at 5 μg/mL (a) and 1μg/mL (b)

第一種方式采用5μg/mL和1μg/mL溶液制備樣品，在空氣中進(jìn)行 AFM成像。由圖2可知，隨著溶液質(zhì)量濃度的降低，云母片表面銀合歡多糖形貌由膜狀變成顆粒狀，顆粒的直徑從20～200nm，表明溶液有較大的黏性，并且室溫條件下分子呈聚集狀態(tài)。

2.3.2 單分子形貌

2.3.1 節(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，獲得單分子圖像的溶液濃度仍舊較大，且分子分散較難。糖鏈的密度依賴于多糖初始質(zhì)量濃度以及其沉積在云母片上的量；為此用第二種制樣方式并改用質(zhì)量濃度為1μg/mL與0.1μg/mL的多糖溶液制樣。由圖3a、b可知，加入表面活性劑吐溫-80，分子的聚集明顯降低，在低質(zhì)量濃度時(0.1μg/mL)溶液呈現(xiàn)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，并得到了單個分子的形貌圖[13]。

圖3 質(zhì)量濃度為0.1μg/mL銀合歡種子多糖的掃描圖象Fig.3 Scanned images of Leucaena glaucal seed polysaccharides at 0.1 μg/mL

圖3 a～c可知，質(zhì)量濃度較低時，可觀察到銀合歡種子多糖分子的單分子形貌。單糖分子為鏈狀，但鏈狀分子并非直線形，而是發(fā)生螺旋、折疊、卷繞、分支。單個的多糖分子鏈中存在側(cè)枝，多個分子鏈間互相纏繞，鏈間通過糖單元間不同的連接方式而形成網(wǎng)格狀或長鏈狀，其中有大大小小的網(wǎng)格，大小尺寸在10～100nm 范圍內(nèi)，這可能與多糖大分子具有高度分支的化學(xué)結(jié)構(gòu)和單分子鏈的末端受到云母片的摩擦力以及多糖鏈內(nèi)三維結(jié)構(gòu)的相互作用力有關(guān)。 圖3b為三維結(jié)構(gòu)圖，表明銀合歡種子多糖在溶液中由于聚集而高度不同，在8～15nm之間，銀合歡種子多糖表面形貌為凹凸不平，由許多高底不等、似山峰形狀的突起結(jié)構(gòu)組成，排列成不規(guī)則的突起結(jié)構(gòu)。直接證實(shí)了多糖大分子具有高度分枝的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

圖3d是圖3a的一個截面線性分析圖，由圖象和數(shù)據(jù)表明，銀合歡種子多糖分子單鏈的厚度為0.235nm(一般多糖單分子的高度范圍約為 0.1～1nm)[14-15]，因分子的高度不受“增寬效應(yīng)”的影響，高度測量值為分子直徑大小的真實(shí)值[12]。寬度為27.581nm，長度從幾十納米到幾個微米不等。分子的高度和寬度因測量位置的不同稍有差異。寬度測量值與針尖曲率半徑有很大關(guān)系，實(shí)驗(yàn)中所用探針針尖的曲率半徑大約為15nm，非常接近單分子多糖鏈的寬度(約為10nm)，當(dāng)探針針尖掃描多糖分子時，其針尖的不同區(qū)域與多糖分子的相互作用力導(dǎo)致了圖象的加寬，使分子的寬度(27.581nm) 遠(yuǎn)大于其真實(shí)值[16-17]?！凹訉捫?yīng)”可以通過使用超級“尖銳”探針針尖得以減小[18]。

3 討 論

利用原子力顯微鏡可視化了因制備條件不同的銀合歡半乳甘露聚糖表現(xiàn)不同的流變學(xué)特性在云母表面形成的不同形貌。不同質(zhì)量濃度下及添加表面活性劑可得到多糖溶液的聚集態(tài)和單分子形貌；銀合歡多糖分子呈線性螺旋狀具有短的分枝，分子直徑為28nm左右。

Kirky等[15]研究表面多糖分子間存在螺旋(有序)螺圈(無序)間的逆熱轉(zhuǎn)換，且螺旋結(jié)構(gòu)在低溫和高離子強(qiáng)度下穩(wěn)定。多糖鏈多股分支緊密排列，相互交聯(lián)，這種現(xiàn)象可能是由于多糖中分子間范德瓦爾斯力相互作用以及糖鏈間氫鍵締合所致[17]，也有可能是分子內(nèi)的相互作用開始締合成多股分子的膠束，其臨近膠束多糖分子鏈上羥基間的緊密接觸有利于分子間形成氫鍵，相互作用下形成分子膠態(tài)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。多糖顆粒狀聚集體結(jié)構(gòu)有可能是多糖分子相互借助氫鍵和范德瓦爾斯力連接在一起，形成以聚集體為單位的顆粒狀布局。在半乳甘露聚糖分子結(jié)構(gòu)中半乳糖和甘露糖的相對比值對溶液的流變學(xué)性質(zhì)有很大的影響，相同條件下半乳糖成分高的溶液黏度相對較大，也是銀合歡多糖稀溶液仍有較大黏度的主要原因。

[1]蔣建新, 張衛(wèi)明, 朱莉偉, 等. 半乳甘露聚糖植物膠的研究進(jìn)展[J].中國野生植物資源, 2001, 20(4): 1-5.

[2]王秀艷, 董麗松. 原子力顯微鏡在多糖結(jié)構(gòu)研究中的進(jìn)展[J]. 高分子通報, 2004(1): 50-56.

[3]楊世平, 孫潤廣, 陳國梁, 等. 紅棗多糖微結(jié)構(gòu)的原子力顯微鏡觀測[J]. 陜西師范大學(xué)學(xué)報: 自然科學(xué)版, 2005, 33(3): 59-61.

[4]聶明, 偉瓊, 彭王君, 等. 鈍頂螺旋藻表面微觀形貌的原子力顯微鏡研究[J]. 生物技術(shù), 2005, 15(6): 69-62.

[5]李斌. 原子力顯微鏡在多糖研究中的應(yīng)用進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2005, 26(4): 264-269.

[6]蔡林濤, 李萍, 陸祖宏. 原子力顯微鏡觀察蟲草多糖分子的結(jié)構(gòu)形貌[J]. 電子顯微學(xué)報, 1999, 18(1): 103-105.

[7]莫其逢, 黃創(chuàng)高, 田建民, 等. 原子力顯微鏡與表面形貌觀察[J]. 廣西物理, 2007, 28(2): 46-49.

[8]孫潤廣, 張靜. 甘草多糖螺旋結(jié)構(gòu)的原子力顯微鏡研究[J]. 化學(xué)學(xué)報, 2006, 64(24): 2467-2472.

[9]MCINTIRE T M, PENNER R M, BRANT D A. Observation of a circular, triple 2 helical polysaccharide using noncontact atomic force microscopy [J]. Macromolecules, 1995, 28: 6375-6377.

[10]徐平平, 孫潤廣, 張靜, 等. 女貞子多糖結(jié)構(gòu)的原子力顯微鏡研究[J].電子顯微學(xué)報, 2009, 28(12): 157-161.

[11]秦利鴻, 曹建波, 易偉松, 等. 綠茶多糖的掃描電鏡制樣新方法及原子力顯微鏡觀察[J]. 電子顯微學(xué)報, 2009, 28(12): 162-167.

[12]郭守軍, 楊永利, 黃云珠, 等. 銀合歡種子膠的主要性能指標(biāo)及流變性研究[J]. 食品科技, 2009, 34(5): 254-259.

[13]李國有, 楊永利, 陳勇, 等. 不同方式制備長角豆半乳甘露聚糖樣品的原子力顯微鏡觀察[J]. 高分子材料科學(xué)與工程, 2006, 22(1): 199-202.

[14]FENG Tao, GU Zhengbiao, JIN Zhengyu, et al. Isolation and characterization of an acidic polysaccharide from Mesona blumes gum[J]. Carbohydrate Polymers, 2008, 71:159-169.

[15]KIRKY A R, GUNNING A P, MORRIS V J, et al. Observation of the helical structure of the bacterial polysaccharide acetan by atomic force microscopy[J]. Biophys J, 1995, 68(1): 360-363.

[16]ABU-LAI N I. An atomic force microscopy look at the molecular world of living bacteria[M]//CAMESANO T, MELLOW C. Microbial surfaces: structure, interactions, and reactivity. Washington, DC: American Chemical Society Publications, 2007.

[17]柳紅, 張靜. 南瓜AP1 多糖結(jié)構(gòu)的分析和原子力顯微鏡研究[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(5): 55-59.

[18]HANSMA H G, VESENKA J, SIEGERIST C, et al. Reproducible imaging and dissection of plasmid DNA under liquid with the atomic force microscopy[J]. Science, 1992, 256: 1180-1184.

Microstructural Observation of Leucaena glaucal Seed Polysaccharides under Atomic Force Microscope

YANG Yong-li1， GUO Shou-jun1， YE Wen-bin2，PAN Xian-hui2，LIN Yue-juan3，LIN Hai-xiong1
(1. Department of Biology, Hanshan Normal University, Chaozhou 521021, China；2. College of Life Science, Northwest Normal University, Lanzhou 730070, China；3. Analysis and Testing Center, Shantou University, Shantou 515063, China)

Objective: The microstructure of Leucaena glaucal seed polysaccharides was studied based on morphological observation under atomic force microscope (AFM). Methods: Polysaccharides from were extracted by hot water extraction. The structure and morphology of aggregates and non-aggregates from Leucaena glaucal seed polysaccharides formed through varying polysaccharide concentration or chemically modifying the surface of mica substrates were visualized under AFM. Results: Membranous, granular aggregates structure and non-aggregate structure of a single polysaccharide molecule could be observed in the samples prepared at various conditions. Conclusion: A single Leucaena glaucal seeds polysaccharide molecule was linear spiral, and had short branch structure and entangled molecular chains to form a reticulation structure.

atomic force microscope； Leucaena glaucal seed polysaccharide； microstructure

TS207.3

A

1002-6630(2012)15-0099-04

2011-06-23

廣東省自然科學(xué)基金資助項目(06028879)；韓山師范學(xué)院教授基金資助項目(510076)

楊永利(1965—)，女，教授，碩士，研究方向?yàn)橹参镔Y源學(xué)及功能食品研究及開發(fā)。

E-mail: rose_kally@yahoo.com.cn