梅 晶，祖桂芳，趙曉紅*，何 穎，孫 健

(北京聯(lián)合大學應用文理學院，北京 100191)

北京早園竹葉不同提取組分對CHO細胞Akt信號通路的影響

梅 晶，祖桂芳，趙曉紅*，何 穎，孫 健

(北京聯(lián)合大學應用文理學院，北京 100191)

通過比較北京早園竹葉提取物中的主要活性組分黃酮苷類、酚酸類及總提取物3個組分對中國倉鼠卵巢細胞(CHO)的增殖、凋亡及Akt信號通路作用差別，考察竹葉提取物對正常細胞可能產(chǎn)生有害作用的活性組分。采用MTT法檢測細胞增殖作用、Annexin V-FITC/PI雙染流式法測細胞凋亡、In Cell Analyzer 1000活細胞圖像分析系統(tǒng)測定Akt信號通路的活化。結(jié)果顯示：1)50～400μg/mL范圍內(nèi)3種組分對細胞存活率的影響無明顯變化，當質(zhì)量濃度≥800μg/mL時細胞增殖率明顯下降(P＜0.05)，細胞毒性作用明顯，且以酚酸類組分作用最強；2)不同組分的竹葉提取物在200～800μg/mL范圍內(nèi)與空白組比較均可降低細胞凋亡率(P＜0.05)，但總提取物和黃酮苷類在質(zhì)量濃度為1600μg/mL時本身可誘導CHO細胞的凋亡增加，差異顯著(P＜0.05)，且以黃酮苷類誘導的細胞凋亡率最高，達14.21%；3)與對照組比較，黃酮苷類在100～800μg/mL劑量條件下，對Akt的活性無明顯影響，總提取物在400、800μg/mL時Akt的激活率明顯增加(P＜0.01)，而酚酸類在100～800μg/mL范圍內(nèi)，隨劑量增加，激活率增高，呈明顯的劑量-反應關系(r=0.996，P＜0.01)。由此可見3種不同提取物組分對CHO細胞的作用是有差別的，其中酚酸類可能是產(chǎn)生有害作用的主要組分。

竹葉提取物；黃酮苷類；酚酸類；細胞增殖；細胞凋亡；Akt通路；中國倉鼠卵巢細胞

我國竹子資源豐富，但絕大部分尚未得到充分的開發(fā)利用。早園竹作為主要的觀賞竹類，在北京各處均有分布，具有一定的開發(fā)應用價值。竹葉黃酮是從竹葉中提取出來的具有生理活性的生物黃酮，包括黃酮類、內(nèi)酯類和酚酸類化合物，是一組復雜而又具有相互協(xié)同增效作用的混合物[1]。許多研究已證明竹葉提取物具有較強的抗自由基、抗氧化、抗衰老、抗菌、抗病毒及保護心腦血管、防治老年退行性疾病等生物學功效[2-4]。植物提取物對健康具有有益和有害的雙重作用，目前的研究更多關注的是其有益的生理作用，而對植物提取物可能的不良作用研究資料比較少見。我們的前期工作以北京早園竹為材料，初步提取和分離出竹葉中的主要活性組分為黃酮類和酚酸類化合物，并觀察總提取物和這兩個組分對細胞增殖的影響和抗H2O2誘導的DNA損傷作用，研究發(fā)現(xiàn)不同組分在低劑量范圍內(nèi)都具有促進細胞增殖作用并具有抗H2O2誘導的DNA損傷作用，也發(fā)現(xiàn)不同組分在較低劑量下呈現(xiàn)一定的DNA損傷作用，以黃酮類的作用效果最為明顯[5]。竹葉提取物中是哪些組分發(fā)揮主要的生物活性作用、其作用機制如何，有待于深入研究。

磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase，PI-3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)，簡稱PI3K/Akt。PI3K/Akt信號通路是參與細胞生長、增殖、分化調(diào)節(jié)的信號轉(zhuǎn)導通路。其中Akt是PI3K信號轉(zhuǎn)導途徑中一個重要的下游靶激酶。把Akt作為分子靶點篩選活性物質(zhì)，可直接揭示化合物與靶點之間的作用機制[6]。研究表明，PI3K/Akt通路的異常激活是多種人類癌癥的突出特征。Akt在大多數(shù)腫瘤中表現(xiàn)為過度活化，因此被認為是一個極有意義的癌癥治療靶點[7]。研究證明生物活性物質(zhì)，如白藜蘆醇可通過抑制Akt信號通路和下游靶分子抑制人類腫瘤細胞的增殖[8]，而活性物質(zhì)對正常細胞的Akt信號通路是否也有影響尚未見報道。因此本課題選擇竹葉提取物的3種不同組分分別作用于CHO細胞，觀察其對細胞增殖、凋亡及Akt信號通路的影響并比較其作用差別，為進一步開展活性物質(zhì)有益及有害作用的研究提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CHO-Akt-EGFP細胞株，由美國GE公司提供。

竹葉提取物制備[9]：采集新鮮竹葉(北京鷹山國家森林公園)經(jīng)晾干、粉碎、過80目篩后，稱取400g竹粉，用80%乙醇，溫度70℃，料液比為1:15，提取時間為120min，提取兩次，合并提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸至無乙醇味，凍干，得竹葉粗提取物54.5g，作為總提取物組。將總提取物重新溶水、SP825大孔樹脂過柱，依次用10%、30%、60%的乙醇水溶液洗脫，干燥，用高效液相色譜(HPLC)分析并獲得黃酮苷類組分和酚酸類組分樣品。在10%乙醇洗脫液中主要為酚酸類，含量約0.31%，作為酚酸類組；30%乙醇洗脫液中主要為C-黃酮苷類，含量約5%，作為黃酮苷類組；60%乙醇洗脫液中未檢測到明顯活性成分，不再進一步使用。所得到的竹葉總提取物和不同組分分別用去離子水配成質(zhì)量濃度為5000mg/L的母液(加樣前稀釋)。

F-12培養(yǎng)基、新生小牛血清(NBS) 美國Gibco公司；青鏈霉素(PS)、胰蛋白酶(0.25% Trypsin) 美國Invitrogen公司；四甲基偶氮銼藍(MTT) 美國Amresco公司；細胞凋亡檢測試劑盒 北京寶賽公司；胰島素樣生長因子-1(IGF-1)、渥曼青霉素(Wortmannin) 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

超凈工作臺 北京百劍空氣凈化設備廠；Forma 3110 系列CO2培養(yǎng)箱 美國Thermo Electron 公司 ；TE2000-M倒置顯微鏡 日本Nikon公司；MLS-3750型高溫蒸汽滅菌器 日本Sanyo公司；5840R冷凍離心機德國Eppendorf公司；MQX200 微板分光光度計 美國Bio-Tek公司；FACSCalibur流式細胞儀 美國BD公司；IN Cell Analyzer 1000活細胞成像系統(tǒng) 美國GE公司。

1.3 方法

1.3.1MTT法檢測細胞增殖

將CHO細胞以5×104個/mL接種于24孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h后用D-Hanks液洗3次，加入0、50、100、200、400、800、1600μg/mL 竹葉提取物組分，每個質(zhì)量濃度設3個平行樣，培養(yǎng)20h，棄上清，每孔加入0.9mL無血清培養(yǎng)液和0.1mL MTT(5mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4h，離心10min，棄上清，每孔加入DMSO 1mL，振蕩待其充分溶解后，于96孔培養(yǎng)板中每孔加入100μL，每孔設3個平行，測OD570nm值，按公式(1)計算細胞增殖率，其中零加藥組為溶劑對照組，空白組為不加細胞的溶劑對照組。

1.3.2 流式細胞儀檢測細胞凋亡

將CHO細胞以5×104個/mL接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h后加入0、200、400、800、1600μg/mL的竹葉提取物的總提取物、酚酸類及黃酮苷類組分，繼續(xù)培養(yǎng)18h，胰酶消化收集細胞，4℃預冷PBS洗兩次，重懸于300μL Binding Buffer中，參照寶賽公司試劑盒操作方法進行Annexin V-Cy5與碘化丙啶(PI)雙染，用FACS Calibur流式細胞儀對進行凋亡檢測，計算細胞凋亡率。

1.3.3IN Cell Analyzer 1000檢測Akt通路

將處于對數(shù)生長期的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了GFP-Akt的CHO細胞接種到96孔板上，每孔200μL，細胞濃度為5×104個/mL，先室溫培養(yǎng)1h，再置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱24h，棄去上清，用檢測培養(yǎng)基洗滌，于150μL檢測培養(yǎng)基室溫培養(yǎng)1h，每孔加入50μL的待測樣品，同時設空白對照組(加不含血清培養(yǎng)基)對綠色熒光細胞進行實時拍照，拍照間隔為30min，連續(xù)取像24h。選用Plasma Membrane Spot Analysis Module分析模板對圖像進行分析，以熒光細胞占所有細胞的百分比值，即激活率(%)來反映Akt通路激活的情況。

1.4 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)均以χˉ±s表示。應用SPSS12.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，不同處理與對照組比較采用單因素方差分析(ANOVA)中的Dunnet檢驗，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析及多重比較LDS方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 竹葉提取物不同組分對CHO細胞增殖的影響

圖1 不同竹葉提取物作用24h對CHO細胞增殖的影響(±s，n=3)Fig.1 Effects of bamboo leaf extracts on CHO cell proliferation (s，n=3)

由圖1可知，作用時間為24h時低質(zhì)量濃度的總提取物組分的細胞增殖率略高于黃酮苷類和酚酸類，而在較高質(zhì)量濃度時，黃酮苷類組分的細胞增殖率均高于總提取物組分和酚酸類組分。在各質(zhì)量濃度下，均以酚酸類組分的細胞增殖率最低，說明不同竹葉提取物組分對細胞增殖的影響作用不同，以酚酸類組分的細胞毒性作用最強。觀察受試物不同劑量對細胞增殖的影響，結(jié)果可見在50～400μg/mL范圍內(nèi)對細胞存活的影響不明顯，當質(zhì)量濃度≥800μg/mL時細胞增殖率明顯下降(P＜0.05)，顯示明顯的細胞毒性作用，說明竹葉提取物的細胞毒性作用較低。

2.2 不同提取物對細胞凋亡的影響

表1 竹葉提取物不同成分對CHO細胞凋亡的影響±s，n=3)Table 1 Effect of bamboo leaf extracts on CHO cell apoptosis±s，n=3)

表1 竹葉提取物不同成分對CHO細胞凋亡的影響±s，n=3)Table 1 Effect of bamboo leaf extracts on CHO cell apoptosis±s，n=3)

質(zhì)量濃度/(μg/mL)凋亡率/%總提取物黃酮苷類酚酸類空白組6.59±0.126.59±0.066.59±0.05 2001.72±0.15*2.30±0.10*#1.46±0.10 * 4001.67±0.02*3.64±0.04*#3.63±0.13*#8005.55±0.1*3.48±0.21*#4.98±0.69* 16009.73±0.02*14.21±0.25*#5.29±0.07*#

由表1可見，不同組分的竹葉提取物在200～800μg/mL范圍內(nèi)與空白組比較均可降低細胞凋亡率(P＜0.05)，總提取物和黃酮苷類在質(zhì)量濃度為1600μg/mL時可誘導CHO細胞的凋亡明顯增加，與空白組比較有顯著差異(P＜0.05)。3種不同組分誘導細胞凋亡的作用不同，高劑量組以黃酮苷類誘導的細胞凋亡率最高，達14.21%。由此可見，竹葉提取物不同組分在低質(zhì)量濃度下能抑制CHO細胞凋亡，但在毒性劑量下可誘導細胞凋亡率增加。

2.3 竹葉提取物對CHO細胞Akt激活影響

CHO細胞以5×104個/mL鋪板，培養(yǎng)24h后加入不同質(zhì)量濃度的提取物，培養(yǎng)24h，同時設Akt激活劑IGF-1(2μg/mL)、抑制劑Wortmannin(500ng/mL)作為對照，Akt激活的細胞圖像見圖2。分析不同質(zhì)量濃度竹葉提取物組分熒光細胞占所有細胞的百分比值。所得激活率見圖3。

圖2 不同竹葉提取物組分對CHO細胞Akt的激活作用Fig.2 Akt signaling pathway activation in CHO cells by different concentrations of bamboo leaf extracts

由圖2可見，當加入激活劑IGF-1后，細胞形態(tài)沒有變化，但邊緣明顯變亮，Akt蛋白被激活，從胞質(zhì)聚集到細胞膜上，而抑制劑Wortmannin作用后細胞沒有明顯變化，說明實驗方法可行。與空白組比較，加入不同提取物組分后CHO細胞邊緣略有變亮，以酚酸類最明顯，但對細胞形態(tài)無明顯影響。通過統(tǒng)計熒光顆粒的數(shù)量及面積用激活率表征Akt的活化水平。

由圖3可見，與空白組比較，在受試劑量下，黃酮苷類對Akt的活性無明顯影響，總提取物在400、800μg/mL時Akt的激活率明顯增加(P＜0.01)，而酚酸類在100～800μg/mL范圍內(nèi)，隨劑量增加，激活率增高，呈明顯的劑量-反應關系(r=0.996，P＜0.01)。比較3種不同提取物組分對加Akt激活的影響，可見酚酸類的作用最明顯，總提取物的增高與其含酚酸類物質(zhì)相關，由此說明，不同竹葉提取物組分對CHO細胞Akt活性的影響不同。

圖3 不同竹葉提取物組分對CHO細胞Akt激活的影響Fig.3 Activation rates of different concentrations of bamboo leaf extracts on Akt signaling pathway in CHO cells

3 討 論

細胞凋亡是機體生長、分化、發(fā)育和病理過程中由基因編碼調(diào)控的細胞主動自殺過程，正常的細胞凋亡在維持生物機體細胞增殖與死亡的平衡過程中起重要作用，但異常的細胞凋亡是某些重要疾病發(fā)病的重要原因，因此細胞凋亡是當前生命科學研究中最熱門的領域之一[10]。本研究結(jié)果表明竹葉提取物的3種組分對正常細胞的凋亡沒有明顯影響。

高通量篩選評價系統(tǒng)是目前新興的細胞組學研究的一個重要技術(shù)手段，可應用于細胞內(nèi)目標分子核轉(zhuǎn)移、靶蛋白表達、報告基因表達、受體激活等方面的研究[11-12]。IN Cell Analyzer 1000活細胞圖像分析系統(tǒng)將熒光共聚焦細胞成像系統(tǒng)和全自動圖像分析系統(tǒng)整合，實時檢測受試物對細胞的作用，且可得到整個細胞群和單個細胞的具體數(shù)據(jù)。由于綠色熒光蛋白(GFP)容易被熒光顯微鏡跟蹤檢測的特性，在信號轉(zhuǎn)導通路研究和細胞篩選中適合作為報告標記因子。當篩選化合物作用于不同的穩(wěn)定表達GFP融合蛋白的細胞時，不同的GFP融合蛋白呈現(xiàn)出與活性反應相關的轉(zhuǎn)運，因此可用于評價與確認活性物質(zhì)對細胞內(nèi)相應信號通路的影響與作用[13]。

PI3K/Akt是一條重要的維持細胞生存的信號通路，能刺激細胞增殖并抑制細胞凋亡。生理狀態(tài)下，Akt蛋白以低活性(失活狀態(tài))存在于細胞漿。當其暴露于各種刺激因素如生長因子缺乏、紫外線照射或DNA損傷等時，Akt蛋白從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細胞膜并獲得催化活性。CHO-AKT-EGFP中的Akt-EGFP在未受到刺激時，綠色熒光呈彌散分布，受刺激后Akt蛋白活化，Akt-EGFP迅速轉(zhuǎn)移到細胞膜上形成高亮度的熒光顆粒，通過統(tǒng)計這種熒光顆粒的數(shù)量及面積就可以表征Akt的活化水平[6-14]。本實驗采用IN Cell Analyzer 1000系統(tǒng)中的穩(wěn)定細胞株CHOAkt-EGFP作為細胞模型，以竹葉總提取物，經(jīng)過分離的黃酮苷類以及酚酸類為實驗材料研究了竹葉提取物對CHO細胞的細胞毒性作用、凋亡誘導作用和刺激Akt蛋白活化的作用，結(jié)果顯示，3種不同組分對細胞的影響不同，由于酚酸類組分的細胞毒性作用比較強，因此導致其激活Akt蛋白的作用也最強。而對細胞增殖的影響在＜1600μg/mL質(zhì)量濃度下沒有明顯差異。

植物化學物質(zhì)毒性作用評價及其機制研究是保健食品風險評估與安全性保障的基礎，而目前更多關注的是其有益的生物活性作用，大多數(shù)研究報道主要是針對植物總提取物和不同組分的研究，但單體物質(zhì)毒性作用特點與提取物間可能存在較大差異，因此需要對這些組分中的主要單體物質(zhì)進行進一步的研究，用活細胞成像系統(tǒng)進行動態(tài)觀察，以明確其作用時間及特點，為竹葉活性物質(zhì)的開發(fā)與應用提供基礎數(shù)據(jù)。

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Effects of Different Components Extracted from Phyllostachys praecoχ. C.d. Chu et C.S. Chao Leaves Grown in Beijing on Akt Signaling Pathway in CHO Cells

MEI Jing，ZU Gui-fang，ZHAO Xiao-hong*， HE Ying，SUN Jian
(College of Applied Arts and Sciences, Beijing Union University, Beijing 100191, China)

The effects of the crude ethanol extract of Phyllostachys praecoχ. C.d. Chu et C.S. Chao leaves grown in Beijing and its major active components, flavoneglycosides and phenolic acids, on the proliferation, apoptosis and Akt signaling pathway of Chinese hamster ovary (CHO) cells were compared to investigate whether the crude ethanol extract has the potential to produce active components harmful to normal cells. The proliferation, apoptosis and Akt signaling pathway activation of CHO cells were measured by MTT assay, Annexin V-FITC/PI double-staining flow cytometry and In cell Analyzer 1000, respectively. The results showed that: 1) the crude ethanol extract and its components had no obvious effect on the viability of CHO cells at doses ranging from 50 to 400μg/mL. the proliferation rate significantly decreased at doses ≥ 800μg/mL (P＜ 0.05) and distinct cytotoxicity was observed and the phenolic acid fraction revealed the strongest cytotoxicity; 2) all the tested samples significantly decreased apoptosis in CHO cells at doses between 200 and 800μg/mL (P＜ 0.05). However, the crude ethanol extract and its flavoneglycoside fraction exhibited apoptosis-inducing effect at the dose of 1600μg/mL with a significant difference (P ＜0.05) and the latter resulted in higher apoptosis rate, 14.21%; 3) the flavoneglycosides had little effect on Akt signaling pathway activation at doses ranging from 100 to 800μg/mL compared with the control, but Akt signaling pathway activation increased significantly in the presence of the crude extract at the doses of 400μg/mL and 800μg/mL (P ＜ 0.01). Akt signaling pathway activation increased in a significant dose-effect fashion along with the increasing dose of the phenolic acids (P＜ 0.01). From these results, it can be concluded that the crude ethanol extract and its two fractions have different effects on CHO cells and that the phenolic acid fraction may consist of major toxic components.

bamboo leaf extract；flavoneglycosides；phenolic acids；cell proliferation；apoptosis；Akt signaling pathway；CHO cells

中圖分類號：Q946；R994.4 文獻標識碼：A 文章編號：1002-6630(2012)03-0248-04

2011-01-12

北京市自然科學基金項目(7092015)；北京聯(lián)合大學學生課外科技學術(shù)作品項目

梅晶(1984—)，女，碩士研究生，主要從事生物活性物質(zhì)的功能與毒理學研究。E-mail：jing_m2008@126.com

*通信作者：趙曉紅(1961—)，女，研究員，博士，主要從事生物活性物質(zhì)的功能與毒理學研究。E-mail：xiaohong@ygi.edu.cn