劉金哲，史小青，姚艷飛，王 莘*

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130118)

香菇發(fā)酵葛根生產(chǎn)總黃酮的工藝研究

劉金哲，史小青，姚艷飛，王 莘*

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130118)

目的：研究香菇發(fā)酵葛根對總黃酮得率的影響。方法：通過單因素及正交試驗進(jìn)行培養(yǎng)基篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化。結(jié)果：總黃酮得率較高的培養(yǎng)基配方(g/100mL)為：玉米粉2、蛋白胨0.2、磷酸二氫鉀0.5、硫酸鎂0.2；總黃酮得率最佳發(fā)酵條件：香菇菌種子液接種量5%、葛根添加量8g/100mL、溫度35℃、pH 7、轉(zhuǎn)速150r/min、發(fā)酵時間144h。結(jié)論：在上述條件下，香菇發(fā)酵葛根后總黃酮含量達(dá)到2.727mg/g，與對照組(不接香菇)比較含量提高了120.81%。

葛根；香菇；總黃酮；共發(fā)酵

葛根(Radiχ Puerariae lobatae)為豆科植物野葛(Pueraria lobata(Willd.)ohwi)的干燥根[1]，是常用的傳統(tǒng)中藥，屬于我國衛(wèi)生部公布的藥食兩用資源，富含淀粉和黃酮類化合物。現(xiàn)代藥理研究表明，葛根總黃酮及單體葛根素是葛根的主要有效成分，具有維護(hù)心腦血管健康、降血脂、抗癌、抗衰老、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等多種生理功能[2-6]。微生物發(fā)酵中藥是中藥研究的新方向和新內(nèi)容[7-8]，其具有提高已知成分含量[9-10]，提高中藥藥效[11-12]，為中藥活性成分結(jié)構(gòu)修飾[13]，降低毒副作用[14]等優(yōu)勢，從而為保健食品和藥品工業(yè)提供更有價值、更實用的生產(chǎn)原料。

香菇(Lentinus edodes)具有生長繁殖力強(qiáng)，易于培養(yǎng)等優(yōu)點，并在液體發(fā)酵過程中產(chǎn)生豐富的酶系，如纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶等，具有對木質(zhì)纖維素、木質(zhì)素、果膠等物質(zhì)的分解利用能力[15-16]，有利于促進(jìn)葛根中有效成分的釋放。本實驗對香菇發(fā)酵葛根產(chǎn)黃酮工藝進(jìn)行探索，為提高葛根總黃酮得率提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香菇菌種由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物工程實驗室保存；葛根由吉林省長春市宏檢藥店購買，已制成飲片。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯200、葡萄糖20、瓊脂20、磷酸二氫鉀3、硫酸鎂1.5，pH值自然，121℃滅菌20min；種子液培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯200、葡萄糖20、磷酸二氫鉀3、硫酸鎂1.5，pH值自然，121℃滅菌20min；基礎(chǔ)液體發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20、蛋白胨2、磷酸二氫鉀3、硫酸鎂1.5，葛根添加量5g/100mL，pH值自然；115℃滅菌15min。

1.3 方法

1.3.1 香菇菌種子培養(yǎng)

斜面菌種活化2～3次后，在無菌條件下接至裝有200mL種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中密閉搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速150r/min、培養(yǎng)溫度28℃、培養(yǎng)時間48h。

1.3.2 基礎(chǔ)發(fā)酵

按5%接種量將香菇菌種子液接至基礎(chǔ)液體發(fā)酵培養(yǎng)基中密閉搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速150r/min、培養(yǎng)溫度28℃、培養(yǎng)時間288h(即12d)。確定香菇發(fā)酵葛根產(chǎn)總黃酮的最佳時間時，設(shè)不接種香菇為對照組。

1.3.3 葛根總黃酮的超聲輔助提取[17]及發(fā)酵液測定前處理[18-19]

將發(fā)酵一定時間的發(fā)酵混合物在70℃超聲提取30min，重復(fù)提取2次后，取一定量的發(fā)酵液，10000r/min離心10min除菌體，取上清液，用等體積無水乙醚萃取3次脫脂，脫色素，精密吸取水層0.5mL測定總黃酮含量。

1.3.4 總黃酮含量測定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及總黃酮含量測定根據(jù)于村等[20]所述方法進(jìn)行，得出回歸方程為：y＝0.107χ＋0.022，R2＝0.998。

1.3.5 培養(yǎng)基篩選實驗

1.3.5.1 培養(yǎng)基碳源篩選

基礎(chǔ)液體發(fā)酵培養(yǎng)基碳源分別替換為等量的玉米粉、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、葡萄糖，接種香菇菌種144h后，分別取不同碳源的發(fā)酵處理組進(jìn)行總黃酮含量的測定。

1.3.5.2 培養(yǎng)基氮源篩選

基礎(chǔ)液體發(fā)酵培養(yǎng)基氮源分別替換為等量的蛋白胨、酵母粉、硝酸銨、尿素、硝酸鉀，接種香菇菌種144h后，分別取不同氮源的發(fā)酵處理組進(jìn)行總黃酮含量的測定。

1.3.5.3 培養(yǎng)基篩選正交試驗[21-22]

在單因素試驗基礎(chǔ)上，進(jìn)行正交試驗。以總黃酮含量為指標(biāo)，選擇可溶性淀粉質(zhì)量濃度、蛋白胨質(zhì)量濃度、磷酸二氫鉀質(zhì)量濃度、硫酸鎂質(zhì)量濃度4個因素，設(shè)3個水平進(jìn)行正交試驗，因素水平設(shè)計見表1。

表1 液體發(fā)酵培養(yǎng)基篩選正交試驗因素水平表Table 1 Coded values and corresponding actual values of culture medium ingredients for orthogonal array design

1.3.6 發(fā)酵條件優(yōu)化的正交試驗

在基礎(chǔ)液體發(fā)酵培養(yǎng)基篩選試驗基礎(chǔ)上，進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化試驗。以總黃酮含量為指標(biāo)，選擇種子液添加量、葛根添加量、溫度、初始pH值4個因素[23]，每個因素設(shè)3個水平進(jìn)行正交試驗。

表2 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗因素水平表Table 2 Coded values and corresponding actual values of fermentation conditions for orthogonal array design

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理

實驗所得數(shù)據(jù)采用Statistical Product and Service Solutions數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 香菇發(fā)酵葛根最佳時間的確定

圖1 不同發(fā)酵時間總黃酮含量比較Fig.1 Effect of fermentation time on the extraction efficiency of total flavonoids

由圖1可知，對照組(不接種香菇)自振蕩處理144h開始，總黃酮含量由0.888mg/g開始逐漸增高，一直保持增長趨勢但是增幅較小，含量最高為1.235mg/g。香菇發(fā)酵葛根最佳時間144h總黃酮含量達(dá)最大值2.161mg/g。

2.2 培養(yǎng)基篩選單因素試驗結(jié)果

2.2.1 培養(yǎng)基添加碳源的比較結(jié)果

表3 不同碳源對香菇發(fā)酵葛根后總黃酮含量的影響Table 3 Effect of carbon source on the content of general flavonoids in Radiχ puerariae after fermentation

由表3可知，香菇發(fā)酵葛根培養(yǎng)基中添加不同碳源對香菇發(fā)酵葛根產(chǎn)總黃酮的產(chǎn)量不存在顯著性差異(P＞0.05)。從節(jié)約生產(chǎn)成本考慮，選用玉米粉為發(fā)酵培養(yǎng)基碳源。

2.2.2 香菇發(fā)酵葛根培養(yǎng)基添加氮源的比較結(jié)果

由表4可知，培養(yǎng)基中以玉米粉為碳源，添加蛋白胨為氮源有利于顯著提高香菇發(fā)酵葛根后總黃酮含量(P＜0.05)。

表4 不同氮源對香菇發(fā)酵葛根后總黃酮含量的影響Table 4 Effect of nitrogen source on the content of general flavonoids in Radiχ puerariae after fermentation

2.2.3 基礎(chǔ)液體發(fā)酵培養(yǎng)基篩選正交試驗結(jié)果與分析

表5 基礎(chǔ)液體發(fā)酵培養(yǎng)基篩選L9(34)正交試驗結(jié)果及分析Table 5 L9(34)orthogonal array design and results for optimizing culture medium ingredients

從表5的R值可以看出，不同營養(yǎng)成分對香菇發(fā)酵葛根的影響次序為A＞C＞D＞B，最佳配方為A1B1C3D2，即：玉米粉2g/100mL、蛋白胨0.2g/100mL、磷酸二氫鉀0.5g/100mL、硫酸鎂0.2g/100mL。采用最佳培養(yǎng)基配方進(jìn)行驗證實驗，發(fā)酵后葛根總黃酮含量可達(dá)2.603mg/g。

2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化的正交試驗結(jié)果與分析

表6 發(fā)酵條件優(yōu)化L9(34)正交試驗結(jié)果及分析Table 6 L9(34)orthogonal array design and results for optimizing fermentation conditions

從表6的R值可以看出，不同發(fā)酵條件對香菇發(fā)酵葛根的影響次序為C＞D＞A＞B，溫度為最主要影響因素；最佳發(fā)酵條件為A1B2C3D2，即：香菇菌種子液添加量5%、葛根添加量8g/100mL、培養(yǎng)溫度35℃、初始pH值7。采用最佳培養(yǎng)基及最優(yōu)發(fā)酵條件做驗證實驗，總黃酮含量可達(dá)2.727mg/g。

3 結(jié) 論

3.1 通過比較不同發(fā)酵時間的葛根經(jīng)香菇發(fā)酵后總黃酮含量，發(fā)現(xiàn)接種香菇菌種后144h為香菇發(fā)酵葛根提高總黃酮含量的最佳發(fā)酵時間。發(fā)酵時間超過144h時總黃酮含量逐漸減少，與香菇的胞外酶(纖維素酶、果膠酶、淀粉酶)活性隨發(fā)酵時間變化的規(guī)律有較大相關(guān)性[24]。3.2對香菇發(fā)酵葛根這一復(fù)雜的發(fā)酵代謝過程而言，采用不同的考察指標(biāo)，優(yōu)化發(fā)酵條件的實驗結(jié)果可能是不同的，本實驗主要是研究有利于提高總黃酮含量的工藝，因此研究獲得的最佳培養(yǎng)基與發(fā)酵條件僅是在此指標(biāo)下的優(yōu)化結(jié)果，而針對其他代謝產(chǎn)物，需要進(jìn)一步研究。最佳培養(yǎng)基配方為：玉米粉2g/100mL、蛋白胨0.2g/100mL、磷酸二氫鉀0.5g/100mL、硫酸鎂0.2g/100mL。最佳發(fā)酵條件：香菇菌種子液接種量5%、葛根添加量8g/100mL、培養(yǎng)溫度35℃，初始pH值7。

3.3 最佳碳氮比的培養(yǎng)基，適宜纖維素酶解的溫度等對提高黃酮含量起積極作用[16]，本實驗采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基及發(fā)酵條件后，總黃酮含量達(dá)2.727mg/g，與不接種香菇對照組相比提高了120.81%。

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Optimization of Lentinus edodes Fermentation before Extraction of Total Flavnoids from Radiχ Puerariae

LIU Jin-zhe，SHI Xiao-qing，YAO Yan-fei，WANG Xin*
(School of Life Sciences, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

Objective: To determine the effect of Lentinus edodes fermentation on the extraction efficiency of total flavonoids from Radiχ Puerariae and optimize culture medium ingredients and fermentation conditions. Methods: The optimization of medium ingredients and fermentation conditions was carried out using one-factor-at-a-time and orthogonal array design methods. Results: The optimal medium composition (g/100 mL) consisted of corn meal 2, peptone 0.2, monopotassium phosphate 0.5, and magnesium sulfate 0.2, and the optimal fermentation conditions were inoculum amount of 5%, Radiχ Puerariae concentration of 8 g/100 mL, fermentation temperature of 35℃, fermentation pH of 7, rotation speed of 150 r/min, and fermentation time of 144 h. Conclusions: Under these conditions, the content of total flavonoids was 2.727 mg/g, which revealed a 120.81% increase compared with the control group (without the inoculation of Lentinus edodes).

Radiχ Puerariae；Lentinus edodes；total flavonoids；fermentation

Q815

A

1002-6630(2012)03-0212-03

2011-01-16

劉金哲(1987—)，女，碩士研究生，研究方向為微生物發(fā)酵與功能產(chǎn)品開發(fā)。E-mail：307754310@qq.com

*通信作者：王莘(1959—)，女，教授，碩士，研究方向為微生物發(fā)酵與功能產(chǎn)品開發(fā)。E-mail：wangxin5853@126.com