李俊峰，李紅芳，段效輝，門(mén)晉名，宿 烽

(1. 青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東 青島 266042；2. 煙臺(tái)出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東 煙臺(tái) 264000)

耐有機(jī)溶劑脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選及其粗酶酶學(xué)性質(zhì)

李俊峰1，李紅芳1，段效輝2，門(mén)晉名1，宿 烽1

(1. 青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東 青島 266042；2. 煙臺(tái)出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東 煙臺(tái) 264000)

以體積分?jǐn)?shù)2%苯為篩選壓力，利用羅丹明B平板顯色法和搖瓶發(fā)酵法，從采集的花生地土壤樣品中分離篩選得到1株中度耐熱、耐堿脂肪酶產(chǎn)生菌，編號(hào)為H2。通過(guò)形態(tài)觀察、生理生化特性實(shí)驗(yàn)及其16S rDNA基因序列對(duì)菌種進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，H2菌株與短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)的親緣關(guān)系最緊密。通過(guò)研究得到該菌株的搖瓶發(fā)酵條件：產(chǎn)酶培養(yǎng)基為：蛋白胨3%、酵母膏1%、NaCl 0.5%、橄欖油1%，pH7.0，搖瓶發(fā)酵溫度為28℃，搖床轉(zhuǎn)速為180r/min，發(fā)酵周期為48～60h。所產(chǎn)脂肪酶在40℃、pH9.0時(shí)酶活性最高，對(duì)pH值和溫度的適應(yīng)范圍較寬，pH6.0～10.0比較穩(wěn)定，35～50℃具有較高酶活性。

耐有機(jī)溶劑；短小芽孢桿菌；脂肪酶；篩選

脂肪酶(EC3.1.1.3)是一類特殊的酰基水解酶，除能夠催化甘油酯類化合物的水解和合成外，還能在油水界面上催化酯的水解和合成、酯交換、生物表面活性劑的合成、多肽合成、高聚合物合成和手性藥物合成等有機(jī)合成反應(yīng)，它可將甘油三酯分解成脂肪酸和甘油或進(jìn)行其逆反應(yīng)[1-3]，在工業(yè)生產(chǎn)中有著廣泛應(yīng)用。目前，脂肪酶在工業(yè)生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用于食品與營(yíng)養(yǎng)、輕工業(yè)、皮革、香料、化妝品、洗滌劑、有機(jī)合成、藥物合成等領(lǐng)域[4-5]。脂肪酶催化的許多反應(yīng)是在非水相中進(jìn)行的，由于許多微生物和其分泌的酶在有機(jī)溶劑中會(huì)被破壞和失活，限制了生物轉(zhuǎn)化在化學(xué)工業(yè)上的應(yīng)用[6]，因此從自然界中尋找耐有機(jī)溶劑、高活力的脂肪酶菌株，可為脂肪酶開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)。

芽孢桿菌脂肪酶具有來(lái)源廣泛、分子質(zhì)量小、表達(dá)分泌能力強(qiáng)、非水相體系酶學(xué)性質(zhì)突出、催化功能多、穩(wěn)定性好和底物特異性多樣化等優(yōu)點(diǎn)，是當(dāng)前脂肪酶研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一[7-10]。Hun等[11]利用苯與甲苯混合物作為碳源，成功篩選出耐有機(jī)溶劑的脂肪酶生產(chǎn)菌。Sameshima等[12]也從汽油污染的土壤中分離得到了耐苯菌株Rhodococcus opacus B-4，該菌株具有很好的有機(jī)溶劑耐受性，在有機(jī)溶劑中可存活5d并保持催化活性。本實(shí)驗(yàn)以苯為唯一碳源，從環(huán)境樣品中篩選耐受有機(jī)溶劑脂肪酶活性較高的細(xì)菌，采用形態(tài)學(xué)特征、理化性質(zhì)及16S rDNA基因序列鑒定其種屬，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行初步研究，為其進(jìn)一步應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實(shí)驗(yàn)采集的樣品有：鹽堿地土壤、花生地土壤、稻田土壤、金銀灘土壤、油井邊土壤、紅樹(shù)林根基土壤及紅樹(shù)林根部水樣，共7個(gè)樣本。

對(duì)硝基棕櫚酸苯酯(p-NPP) 美國(guó)Sigma 公司；橄欖油 天津口維可國(guó)際貿(mào)易有限公司；羅丹明B 上海試劑三廠；聚乙烯醇(PVA) 天津市巴斯夫化工有限公司；酚酞天津市大茂化學(xué)試劑廠；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 培養(yǎng)基

初篩培養(yǎng)基(g/L)：Na2HPO43.5、KH2PO41.5、MgSO4·7H2O 0.5、NaCl 0.5，pH7.5，121℃高壓蒸汽滅菌20min，無(wú)菌條件下加入體積分?jǐn)?shù)2.0%苯(0.22μm過(guò)濾除菌)；富集培養(yǎng)基(g/L)：Na2HPO43.5、KH2PO41.5、MgSO4·7H2O 0.5、NaCl 0.5、酵母粉 0.2，pH7.5，再加乳化橄欖油(將4g聚乙烯醇加熱溶于100mL蒸餾水中，然后與橄欖油以體積比3:1的比例混合，超聲攪拌乳化2min)，121℃高壓蒸汽滅菌20min；油脂同化平板培養(yǎng)基(g/L)：Na2HPO43.5、KH2PO41.5、MgSO4·7H2O 0.5、NaCl 0.5、瓊脂20，橄欖油乳化液體積分?jǐn)?shù)12%、調(diào)至pH7.5，121℃高壓蒸汽滅菌20min，冷卻至45℃左右加羅丹明B，倒平板備用；LB平板培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10、酵母膏5、NaCl 5、瓊脂15、pH7.0，121℃高壓蒸汽滅菌20min，倒平板備用。

產(chǎn)脂肪酶發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：M1：可溶性淀粉25、橄欖油乳化液2.5、蛋白胨15，pH8.5；M2：胰蛋白胨20、豆油3.0、NaNO31、K2HPO41、MgSO45，pH8.0；M3：豆餅粉20、牛肉粉20、可溶性淀粉10、K2HPO45、NaNO35，pH7.0；M4：可溶性淀粉10、豆餅粉20、K2HP4O 5、NaNO32，pH8.5；M5：蛋白胨40、(NH4)2SO41、MgSO4·7H2O 1、K2HPO41，pH 8.0；M6：蛋白胨20、蔗糖10、橄欖油乳化液10、(NH4)2SO45、MgSO45、K2HPO42，pH8.0；M7：蛋白胨30、酵母膏10、NaCl 5、橄欖油10，pH7.0；M8：蛋白胨10、酵母膏5、NaCl 5，pH7.0。

1.3 酶活力測(cè)定

采用棕櫚酸-對(duì)硝基苯酯法測(cè)定[13]。

1.4 菌株的篩選

1.4.1 耐有機(jī)溶劑菌株的篩選

稱取樣品5g放入95mL無(wú)菌水中小火加熱至沸騰，維持1min，殺滅不產(chǎn)芽孢的細(xì)菌，靜置5min，取上清液5mL，加入初篩培養(yǎng)基中28℃、180r/min振蕩培養(yǎng)2d。觀察培養(yǎng)基渾濁度的變化。

1.4.2 產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選

取上述渾濁度較大的培養(yǎng)液適量接種到富集培養(yǎng)基中，富集后取少量菌液涂布到油脂同化平板培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h后在350nm紫外光照射下觀察菌落周?chē)鸁晒馊χ睆降拇笮『妥兓?，選取熒光圈較大的菌落，LB平板培養(yǎng)基劃線進(jìn)行純培養(yǎng)，溫度28℃。

1.5 粗酶液酶學(xué)性質(zhì)研究

M7培養(yǎng)基接種所篩選的H2菌株，28℃、180r/min振蕩培養(yǎng)2d，發(fā)酵液于4℃低溫10000×g離心20min，取上清液，用棕櫚酸-對(duì)硝基苯酯法測(cè)定脂肪酶酶活力，進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究。

1.5.1 有機(jī)溶劑耐受性能考察

在粗酶液中添加終體積分?jǐn)?shù)為25%不同極性常數(shù)(logP)的有機(jī)溶劑，40℃、180r/min振蕩2h后，測(cè)定酶活力。以不加有機(jī)溶劑的原酶液為對(duì)照計(jì)算相對(duì)酶活力。

1.5.2 酶作用最適pH值及其pH值穩(wěn)定性

分別用0.1mol/L HCl或0.1mol/L NaOH溶液調(diào)粗酶液pH值為6.0～10.0，40℃反應(yīng)10min，測(cè)定酶活力，以確定該酶的最適pH值。用0.1mol/L HCl或0.1mol/L調(diào)粗酶液為不同pH值，4℃處理粗酶液12h，回調(diào)至9.0，40℃保溫10min，測(cè)定酶活力，以研究該酶的pH值穩(wěn)定性。以最高酶活力作為100%計(jì)算相對(duì)酶活力，每組重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.5.3 酶作用最適溫度及其熱穩(wěn)定性

取粗酶液，調(diào)pH9.0，分別于25～65℃水浴中反應(yīng)10min，測(cè)定酶活力，以確定該酶的最適溫度。在不同溫度(40～80℃)條件下進(jìn)行酶的熱穩(wěn)定性研究，期間每隔10min測(cè)定酶活力，酶促反應(yīng)條件同上，持續(xù)1h。以最高酶活力作為100%計(jì)算相對(duì)酶活力，每組重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.6 菌株的鑒定

形態(tài)學(xué)特征觀察和生理生化性質(zhì)實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)[14]方法，根據(jù)曾曉希等[15]的方法提取基因組DNA，以其為模板，采用16S rDNA通用引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增其16S rDNA基因序列，將擴(kuò)增片段送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，結(jié)果在NCBI中檢索比對(duì)，獲得有關(guān)種的公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)序列數(shù)據(jù)后采用Clustal X 1.8軟件比對(duì)，使用MEGA 4.0進(jìn)行序列同源性分析并繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，算法為Neighbor-Joining。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐有機(jī)溶劑菌株的篩選

表1 培養(yǎng)液渾濁度的變化Table 1 Change in culture turbidity during incubation of strains from different sources

培養(yǎng)液渾濁度變化見(jiàn)表1，結(jié)果顯示，稻田土壤和花生地土壤樣品在培養(yǎng)初期就變得渾濁，在第3天變得非常渾濁，表明這兩種樣品培養(yǎng)液中的微生物可以有效利用苯，并迅速生長(zhǎng)，其他樣品中微生物利用苯效率較低。因此，選擇來(lái)自稻田地土壤和花生地土壤的微生物培養(yǎng)液進(jìn)行脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選。

在2017年結(jié)束之前，我們?nèi)チ撕芏嗖煌幕疱伒晗M(fèi)，評(píng)頭論足著每一家的優(yōu)缺點(diǎn)，順便攝影。雖然離住家很近，不知不覺(jué)路過(guò)的機(jī)會(huì)也很高，而我再三猶豫，還是毅然決然的，放棄走入西瓜甜點(diǎn)涮涮鍋店內(nèi)消費(fèi)。

2.2 產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選

表2 各菌株的產(chǎn)脂肪酶活力比較Table 2 Comparison of lipase activities produced by strains from different sources

采用油脂同化平板培養(yǎng)基篩選得到6株純培養(yǎng)菌株，分別命名為D1、D2、D3、H1、H2、H3。分別把6株菌接種于LB發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、180r/min的搖床上培養(yǎng)48h后，取上清液測(cè)定酶活力。由表2可知，酶活力最高的是來(lái)自花生地土壤的菌株H2，選擇該菌株做進(jìn)一步研究。

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇

圖1 不同培養(yǎng)基對(duì)H2菌株所產(chǎn)脂肪酶的影響Fig.1 Effect of different culture media on lipase production by strain H2

表3 菌株H2粗酶對(duì)不同有機(jī)溶劑的耐受能力Table 3 Effect of organic solvents on the stability of crude lipase from strain H2

將H2菌株分別接種到發(fā)酵培養(yǎng)基M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7和M8中，于28℃、180r/min振蕩培養(yǎng)48h，測(cè)定其粗酶液的酶活力。由圖1可知，以M7為發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)，脂肪酶酶活力最高，達(dá)到4.53U/mL，以下實(shí)驗(yàn)均選擇M7作為發(fā)酵培養(yǎng)基。

2.4 發(fā)酵周期考察

圖2 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)H2菌株所產(chǎn)脂肪酶的影響Fig.2 Effect of fermentation time on lipase production by strain H2

取不同發(fā)酵時(shí)間的粗酶液進(jìn)行酶活力測(cè)定，由圖2可知，發(fā)酵48h之前，酶活力上升趨勢(shì)比較明顯，發(fā)酵48h之后，酶活力變化趨于穩(wěn)定，到72h酶活力開(kāi)始略有下降。因此發(fā)酵時(shí)間選擇48～60h為宜。

2.5 搖床轉(zhuǎn)速和培養(yǎng)溫度對(duì)H2產(chǎn)脂肪酶的影響

圖3 搖床轉(zhuǎn)速和培養(yǎng)溫度對(duì)H2菌株產(chǎn)脂肪酶的影響Fig.3 Effect of rotational speed and temperature on lipase production by strain H2

2.6 酶學(xué)性質(zhì)初步研究

2.6.1H2菌株粗酶液有機(jī)溶劑耐受性能

由表3可知，總體而言，隨著有機(jī)溶劑logP值的增加，對(duì)酶活性影響逐漸減小，說(shuō)明菌株對(duì)有機(jī)溶劑的耐受性越好。粗酶對(duì)25%苯和甲苯的耐受性較差，苯是篩選H2菌株的壓力條件，說(shuō)明菌株和其分泌的酶對(duì)有機(jī)溶劑的耐受性可以有所不同。細(xì)菌細(xì)胞有細(xì)胞壁和細(xì)胞膜作為屏障，阻礙了有機(jī)溶劑與胞內(nèi)酶的直接接觸，而釋放到胞外的酶直接同有機(jī)溶劑作用，酶活力可能受到影響，如果酶的耐受性不夠，其活性會(huì)降低甚至喪失。

2.6.2H2菌株粗酶最適反應(yīng)pH值及其pH值穩(wěn)定性

圖4 pH值對(duì)H2菌株所產(chǎn)脂肪酶粗酶活性的影響Fig.4 Effect of pH on the activity of crude lipase from strain H2

圖5 pH值對(duì)H2菌株所產(chǎn)脂肪酶粗酶穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of pH on the stability of crude lipase from strain H2

由圖4可見(jiàn)，相對(duì)酶活力最高峰出現(xiàn)在pH 9.0處，表明H2菌株所產(chǎn)脂肪酶在pH值為9.0時(shí)酶活性最高。由圖5可見(jiàn)，H2菌株所產(chǎn)脂肪酶在pH 6.0～10.0范圍內(nèi)比較穩(wěn)定，當(dāng)pH值低于5.0時(shí)，酶活性受到比較大的影響。

2.6.3 H2菌株粗酶最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性

圖6 溫度對(duì)H2菌株所產(chǎn)脂肪酶粗酶活性的影響Fig.6 Effect of temperature on the activity of crude lipase from strain H2

圖7 溫度對(duì)H2菌株所產(chǎn)脂肪酶粗酶穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of temperature on the stability of crude lipase from strain H2

由圖6 可見(jiàn)，相對(duì)酶活力在25～40℃之間隨著溫度的升高而增大，在40℃時(shí)達(dá)到最大，50℃以上相對(duì)酶活力逐漸降低。由圖7可見(jiàn)，H2菌株所產(chǎn)脂肪酶在60℃條件下保溫40min穩(wěn)定性較好，70℃條件下保溫相對(duì)酶活力急劇下降，保溫20min相對(duì)酶活力僅為30%；而在80℃條件下僅保溫10min，酶活力就下降了70%，40min后相對(duì)酶活力幾乎為0，表明該酶在35～50℃之間具有較高的酶活性，H2菌株所產(chǎn)脂肪酶屬于中度耐熱脂肪酶。

2.7 H2菌株鑒定結(jié)果

2.7.1 主要生理生化特性

H2菌株在LB平板培養(yǎng)基上菌落呈圓形，白色，邊緣不整齊，表面粗糙，不透明；經(jīng)革蘭氏染色，確定為革蘭氏陽(yáng)性菌，菌體桿狀，好氧，中生芽孢(圖8)；可利用D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-甘露糖、蔗糖產(chǎn)酸；不消化瓊脂，水解明膠，不利用淀粉；利用檸檬酸鹽，硝酸鹽還原反應(yīng)陰性，并可在含7%以下NaCl的LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)；最適生長(zhǎng)溫度28℃；接觸酶陽(yáng)性；V-P實(shí)驗(yàn)反應(yīng)陽(yáng)性。參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[14]初步鑒定為短小芽孢桿菌。

圖8 H2菌株菌落形態(tài)(a)和菌體形態(tài)(b)(×1600)Fig.8 Colony morphology of strain H2(×1600)

2.7.2 16S rDNA 的擴(kuò)增

按1.5節(jié)方法對(duì)菌株H2的16S rRNA 序列擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳后，在1000～2000bp之間可看到一條清晰條帶，約1500bp(圖9)。割膠回收目的片段進(jìn)行測(cè)序。

圖9 H2菌株16S rRNA序列的PCR電泳圖Fig.9 Agarose gel electrophoresis of 16S rRNA sequence of strain H2

2.7.316 S rDNA序列同源性分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的建立

經(jīng)上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序得到較完整的16S rDNA序列，與NCB1上已有序列進(jìn)行Blast同源性檢索，發(fā)現(xiàn)其16S rDNA 和多數(shù)Bacillus pumilus的同源性達(dá)99%以上，對(duì)該序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖10。發(fā)現(xiàn)進(jìn)化樹(shù)上H2菌株和Bacillus pumilus屬于同一簇，遺傳距離幾乎為0，因此可初步判斷H2菌株的分類地位屬于Bacillus pumilus。同屬于Bacillus屬的枯草芽孢桿菌集中在另外一簇，而其他一些芽孢桿菌菌株則屬于獨(dú)立分支。

3 討 論

從花生地土壤分離篩選得到耐有機(jī)溶劑脂肪酶產(chǎn)生菌H2，經(jīng)產(chǎn)酶發(fā)酵條件的初步研究，確定適宜的發(fā)酵培養(yǎng)基為M7，培養(yǎng)溫度為28℃，搖床轉(zhuǎn)速為180r/min，搖瓶發(fā)酵周期為48～60h。酶學(xué)性質(zhì)初步研究結(jié)果表明：該脂肪酶在40℃，pH 9.0時(shí)酶活性最高，可見(jiàn)H2菌株所產(chǎn)脂肪酶屬于中度耐熱、耐堿脂肪酶；穩(wěn)定性研究表明：該酶在pH 6.0～10.0范圍內(nèi)比較穩(wěn)定，在35～50℃之間具有較高的酶活性，說(shuō)明此酶對(duì)溫度和pH值適應(yīng)的范圍較寬，為其廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)提供了有利條件。脂肪酶在油脂加工、洗滌劑、皮革、造紙、食品、醫(yī)藥、化妝品、紡織等領(lǐng)域都有十分廣泛的應(yīng)用。在食品工業(yè)中的應(yīng)用主要集中在食用油脂改性、改善食品風(fēng)味、改進(jìn)食品質(zhì)量及保健食品生產(chǎn)等方面。由于H2菌株所產(chǎn)脂肪酶可耐受部分有機(jī)溶劑，因此，在有機(jī)溶液中催化酯交換作用來(lái)改變低價(jià)脂肪性能，生產(chǎn)一些重要的多不飽和脂肪酸，利用菜子油生產(chǎn)生物柴油，在玉米油、葵花油、花生油、橄欖油和大豆油的生產(chǎn)等方面都具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

通過(guò)分析H2菌株的16S rDNA基因序列，發(fā)現(xiàn)H2菌株與Bacillus pumilus具有最緊密的親緣關(guān)系。從形態(tài)學(xué)、生理生化特性及分子生物學(xué)水平上的鑒定結(jié)果可確定H2菌株為Bacillus pumilus。H2菌株作為工業(yè)生產(chǎn)菌所具有的優(yōu)勢(shì)有：能形成抗性內(nèi)生孢子——芽孢，有利于菌種的保藏，因其屬于常溫菌，所以可降低工業(yè)化成本，如發(fā)酵條件和設(shè)備要求等。因此，H2菌株具有開(kāi)發(fā)耐熱、耐堿脂肪酶的潛在價(jià)值。該菌株的產(chǎn)酶能力還不能滿足工業(yè)生產(chǎn)要求，有必要通過(guò)誘變和遺傳育種的手段對(duì)H2菌株作進(jìn)一步研究。

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Screening of Organic Solvent Tolerant Lipase-Producing Bacteria and Enzymatic Properties of Crude Lipase

LI Jun-feng1，LI Hong-fang1，DUAN Xiao-hui2，MEN Jin-ming1，SU Feng1
(1. College of Chemical Engineering, Qingdao University of Science and Technology, Qingdao 266042, China；2. Yantai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Yantai 264000, China)

A moderately thermostable and alkali-resistant lipase-producing strain named as H2 was isolated from peanut plantation soil using 2% benzene by Rhodamine B plate assay and shake flask fermentation. It was preliminarily identified based on morphological and physiological characteristics. Meanwhile, the 16S rDNA gene of the strain was cloned and sequenced. The physiological and biochemical characterization and phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequence showed that the strain was highly homologous to Bacillus pumilus. The optimal culture medium for lipase production by the strain was composed of 3% peptone, 1% yeast extract, 0.5% NaCl, 1% olive oil, pH 7.0, and the optimal fermentation conditions of temperature, rotational speed and time were 28 ℃, 180 r/min and 48ˉ60 h, respectively. The lipase produced under these conditions revealed the highest activity at 40 ℃ and pH 9.0. The lipase was stable over a broad range of pH (6.0ˉ10.0) and temperature (35ˉ50 ℃).

organic solvent tolerant；Bacillus pumilus；lipase；screening

Q939.96

A

1002-6630(2012)03-0116-05

2011-01-07

中國(guó)煙草總公司山東省公司科技計(jì)劃項(xiàng)目(KN172)；國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局科研基金項(xiàng)目(2007IK154)

李俊峰(1971—)，男，講師，博士，研究方向?yàn)槲⑸锎x產(chǎn)物。E-mail：lijf1999@qust.edu.cn