侯 靜，古 鋒，徐志文，朱 玲.2＊

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川雅安 625014；2.動(dòng)物生物技術(shù)中心四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川雅安 625014）

白細(xì)胞介素（interleukins，IL）是由活化的單核巨噬細(xì)胞或淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的一類(lèi)主要負(fù)責(zé)信號(hào)傳遞，聯(lián)絡(luò)白細(xì)胞群，調(diào)節(jié)細(xì)胞的活化、增殖和分化作用的細(xì)胞因子。白細(xì)胞介素18（IL－18）屬于IL－1細(xì)胞因子家族成員，為近年發(fā)現(xiàn)的一種分布廣泛的細(xì)胞因子，是一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子，具有多種生物學(xué)功能。1989年Nakamura等從內(nèi)毒素休克的小鼠血清中分離出一種與IL－2功能上有相似之處的蛋白因子，該因子可誘導(dǎo)靜息脾非黏附細(xì)胞產(chǎn)生高水平IFN－γ。1995年Okamnra H等從先經(jīng)熱滅活的痤瘡丙酸桿菌接種后經(jīng)脂多糖攻擊引起中毒性休克的小鼠肝臟中克隆出該因子，因其可誘導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生IFN－γ，故命名為IFN－γ誘導(dǎo)因子（interferonγ－inducing factor，IGIF）［1－3］。1995年又獲得了人IGIF的cDNA克隆，并在大腸埃希菌中成功表達(dá)，于1996年才正式命名為白細(xì)胞介素18（interleukin 18，IL－18）。T、B細(xì)胞幾乎沒(méi)有IL－18mRNA的表達(dá)，主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生。IL－18在清除細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌、病毒、真菌、原核生物［4］等方面起著特別有效的作用，在抗微生物感染、抗自身免疫疾病、抗腫瘤免疫中具有很大應(yīng)用潛力［5－7］。IL－18也被公認(rèn)為一種可以替代傳統(tǒng)療法的新型治療劑和有效的免疫佐劑［8］。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)對(duì)人、鼠、豬，、雞、毛皮動(dòng)物［9－11］等IL－18基因克隆及相關(guān)研究均有報(bào)道。曹殿軍等［12］用犬脾細(xì)胞刺激誘導(dǎo)提取核酸的方法克隆IL－18基因。本研究通過(guò)對(duì)犬外周血白細(xì)胞刺激誘導(dǎo)后，采用RT－PCR技術(shù)克隆犬IL－18基因，并對(duì)其序列進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)犬由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院提供的健康成年家犬。RNA抽提試劑盒購(gòu)至Promega公司；Con A、反轉(zhuǎn)錄酶、Taq酶、RT－PCR試劑盒、BamHⅠ、EcoRⅠ、白細(xì)胞分離液、Marker DL 2 000、膠回收試劑盒、pMD19－T simple vector、質(zhì)粒抽提試劑盒，均購(gòu)至寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取 無(wú)菌采取犬外周血，肝素抗凝，用白細(xì)胞分離液分離外周血白細(xì)胞，經(jīng)Con A刺激誘導(dǎo)，收集白細(xì)胞。用RNA抽提試劑盒提取總RNA，操作方法嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。電泳觀察RNA的完整性，并加RNA抑制酶于－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank上登錄的犬IL－18序列（Y11133），用Oligo軟件設(shè)計(jì)1對(duì)引物，并在兩側(cè)加酶切位點(diǎn)BamHI和EcoRI，加上保護(hù)堿基。引物設(shè)計(jì)序列如下：P1：5′－GGATCCATGGCTGCTAACCTAACCTAATAGAAGAC －3′；P2：5′－GAAT－TC CTAGCTCTTGTTTTGAACAGTGAAC－3′（劃線(xiàn)部分為酶切位點(diǎn)），該引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.2.3 犬IL－18基因的克隆 10μL體系反轉(zhuǎn)錄：1μLRNA，上下游引物各0.5μL，84℃5min后冰浴5min，然后加RNA酶抑制劑及反轉(zhuǎn)錄酶各1μL，42℃水浴1h。10μL體系PCR：1μL RT產(chǎn)物，上下游引物各1μL，PCR Mix 5μL，ddH2O 3μL。反應(yīng)程序如下：95℃5min；95℃45s；54℃30s；72℃45s，35個(gè)循環(huán)；72℃8min。

1.2.4 重組質(zhì)粒構(gòu)建 瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，回收580bp處的DNA片段，與PMD19－T simple vector連接。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布Amp＋平板篩選。挑取單菌落，接種到LB中，37℃下?lián)u床培養(yǎng)12h，抽取質(zhì)粒。通過(guò)BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切鑒定后，將陽(yáng)性重組質(zhì)粒送至寶生物工程（大連）有限公司測(cè)序。DNA Star軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒雙酶切及PCR鑒定

將重組質(zhì)粒進(jìn)行BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切及PCR鑒定，得到與目的基因大小一致的特異性片段，說(shuō)明所克隆的目的基因已成功插入pMD19－T simple vector，初步確定成功克隆了犬IL－18基因（圖1）

圖1 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig.1 Double enzyme digestion analysis of recombinant canine IL－18

2.2 犬IL－18堿基測(cè)序及相關(guān)分析

測(cè)序結(jié)果與GenBank上的犬IL－18基因序列完全一致，全長(zhǎng)為 582bp。狐（EF581889）、貉（EU200969）、羊（AJ401033）、牛（NM＿174091）的IL－18閱讀框均為582bp，結(jié)果顯示氨基酸同源性為96.4%、91.2%、81.4%、79.9%。貓（DQ100372）、兔（EU419127）和豬（NM＿213997）則缺失1個(gè)氨基酸，鼠（NM＿019165）增加1個(gè)氨基酸，其同源性分別為82.9%、67.9%、83.9%、59.3%。犬與貉、狐的同源性最高，與羊、豬、牛、貓同源性也較高（表1）。由DNA Star軟件分析得到IL－18氨基酸進(jìn)化樹(shù)可見(jiàn)犬與貉、狐的親緣關(guān)系最近（圖2）。

表1 犬和其他動(dòng)物IL－18氨基酸序列同源性比較Table 1Comparison amino acid sequence homology of canine IL－18and other animal IL－18

圖2 犬IL－18基因氨基酸序列分子進(jìn)化樹(shù)分析Fig.2 Phylogenetic tree analysis of canine IL－18amino acid sequence

3 討論

犬作為伴侶動(dòng)物，在我國(guó)的養(yǎng)殖范圍不斷擴(kuò)展，病毒病對(duì)養(yǎng)犬業(yè)影響甚大，病毒破壞了犬的免疫系統(tǒng)，出現(xiàn)發(fā)熱發(fā)炎等癥。而IL－18具有免疫調(diào)節(jié)的功能，能激活免疫系統(tǒng)，維持機(jī)體的穩(wěn)定性［3］。犬IL－18是一種重要的細(xì)胞因子，能誘導(dǎo)NK細(xì)胞、T細(xì)胞及巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IFN－γ，還能促進(jìn)T細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)NK細(xì)胞殺傷和Th1細(xì)胞的細(xì)胞毒活性［14］，具有抗腫瘤及抗病毒等作用［15－16］，因而可成為核酸疫苗的重要免疫佐劑［17－18］。使其在多態(tài)性藥物的開(kāi)發(fā)，疾病的預(yù)防與治療等方面具有很大的潛在運(yùn)用價(jià)值，值得做進(jìn)一步的研究。

Con A具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)，增強(qiáng)白細(xì)胞的表達(dá)活性，因此本試驗(yàn)從外周血分離白細(xì)胞，Con A刺激培養(yǎng)18h，并成功克隆犬IL－18，得到堿基序列為582bp。通過(guò)DNA Star分別就犬IL－18與其他哺乳動(dòng)物進(jìn)行同源性分析，與Okano F等［19］從犬肺巨噬細(xì)胞中擴(kuò)增的IL－18堿基序列一致。通過(guò)犬與其他動(dòng)物的氨基酸序列同源性比較，結(jié)果顯示其進(jìn)化關(guān)系與基因水平一致，犬IL－18與同屬犬科動(dòng)物的狐和貉同源性最高，與其他動(dòng)物則存在較大種屬差異。本試驗(yàn)為犬IL－18的表達(dá)及其活性、生物學(xué)功能研究提供了材料。

［1］王軍志.生物技術(shù)藥物研究開(kāi)發(fā)和質(zhì)量控制［M］.2版.北京：科學(xué)出版社，2007：521－522.

［2］Okamura H，Kawaguchi K，Shoji K，et al.High level induction of gamma interferon with various mitogens in mice pretreated with propioni bacterium acnes ［J］.Infect Immun，1982，38（2）：440.

［3］Okamura H，Tsutsui H，Komatsu T，et al.Cloning of a new cytokine that induces IFN－γproduction by T cells［J］.Nature，1995，378：88－91.

［4］Yamauchi K，Choi II－Ju，Lu Hong，et al.Regulation of IL－18 inHelicobacterpyloriInfection［J］，J Immunol，2008，180（2）：1207－1216.

［5］Sennello J A，F(xiàn)Byad R，Pini M，et al.Interleukin－18，together with interleukin－12 ，induceds severe acute pancreatitis in obese but not in leptin－deficient mice［J］.Proc Natl Acad Sci，2008，105（23）：8085－8090.

［6］Bryson K J，wei X Q，Alexander J.Interleukin－18enhances a Th2biased response and sus－ceptibility toLeishmania mexicanain BALB／c mice［J］.Microbes Infect，2008，10（7）：834－839.

［7］Zaki M H，Vogel P，Body－Malapel M，et al.IL－18production downstream of the nIrp3inflammasome coloretal tumor formation［J］.J Immunol，2010，185（8）：4912－4920.

［8］劉文強(qiáng).白細(xì)胞介素－18研究進(jìn)展［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009，30（4）：83－86.

［9］鄭蘭蘭，賈云飛，崔保安，等.豬白介素18基因的克隆、表達(dá)及生物學(xué)活性檢測(cè)［J］.生物工程學(xué)報(bào)，2008，24（2）：214－219.

［10］趙 麗，崔保安，陳紅英，等.海南雞白細(xì)胞介素18成熟蛋白基因的克隆及在大腸桿菌中的表達(dá)［J］.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，29（1）：88－91.

［11］張海玲，羅國(guó)良，趙春霏，等.貉白介素－18（IL－18）基因的克隆及序列分析［J］.特產(chǎn)研究，2008，19（3）：20－24.

［12］曹殿軍，于立輝，閆麗輝，等.犬脾細(xì)胞白介素－18（IL－18）基因的克隆與序列分析［J］.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2003，25（4）：262－264.

［13］Smith D E.The biological paths of IL－1family members IL－18and IL－33［J］.J Leukocyte Biol，2011，89（3）：383－392.

［14］朱永紅，鄒全明.白細(xì)胞介素18受體及其介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［J］.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2001，17（1）：98－100.

［15］楊文剛，劉俊華.白細(xì)胞介素18與腫瘤治療的研究進(jìn)展［A］.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2009，113（2）：412－421.

［16］Lv Jianxin.Expression of targeting IL18－EGF fused protein and its effect on the antineoplastic activityinvitro［J］.Bulle Sci Technol，2009，25（2）：183.

［17］Pasquini S，Xiang Z，Wang Y，et al.Cytokines and costimulatory molecules as genetic adjuvants［J］.Immunol Cell Biol，1997，75（4）：397－401.

［18］王福祥.細(xì)胞因子佐劑對(duì)HIV DNA疫苗免疫效果的影響［J］.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2003，19（6）：620－622.

［19］Okano F，Satoh M，Ido T，et al.Cloning of cDNA for canine interleukin－18and canine interleukin－1beta converting enzyme and expression of canine interleukin－18［J］.Interferon Cytokine Res，1999，19（1）：27－32.