曹 蘭，沈克飛，張邑帆，羅文華，王瑞生，任 勤，郭 軍，王志冬，戴榮國(guó)＊

（1.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶榮昌 402460；2.吉林省舒化市上營(yíng)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，吉林舒化 132607）

蜜蜂囊狀幼蟲?。⊿acbrood）是由囊狀幼蟲病病毒（Sacbrood virus，SBV）感染引起的傳染病。該病最早于1913年發(fā)現(xiàn)于西方蜜蜂（Apismellifera），1971年中國(guó)廣東暴發(fā)中蜂囊狀幼蟲病，1981年從泰國(guó)的印度蜜蜂體內(nèi)分離到SBV。在流行的早期，囊狀幼蟲病對(duì)蜂群損害較大，之后蜂群會(huì)產(chǎn)生一定的抵抗性，蜂群發(fā)病率降低?，F(xiàn)在一般認(rèn)為該病不是西蜂的主要疾病。然而，囊狀幼蟲病對(duì)東方蜜蜂（Apiscerana）的危害仍十分嚴(yán)重，是侵害幼蟲的主要傳染病。中蜂（Apisceranacerana）蜂群囊狀幼蟲病的發(fā)病率仍在50%～70%。

已有的研究表明，分離自不同蜜蜂種類和地理種群蜜蜂宿主的囊狀幼蟲病病毒的基因組序列存在差異。Grabensteiner E等［1］依據(jù)擴(kuò)增自6個(gè)國(guó)家16份西蜂樣本的占基因組37.7%的不同區(qū)域的5個(gè)片段序列，對(duì)SBV進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，一致性地得出至少可將其分成歐洲型、遠(yuǎn)東型和南非型3個(gè)基因型。中蜂患囊狀幼蟲病習(xí)慣上稱為中蜂囊狀幼蟲病，其病原稱為中蜂囊狀幼蟲病病毒（Chinese sacbrood virus，CSBV）。早期研究指出，CSBV 和SBV除了在生理和生化特性上相似外［2］，在蛋白質(zhì)組分［3］、抗原性上有所不同，且不發(fā)生交叉感染［4］。對(duì)流行于國(guó)內(nèi)的CSBV基因組序列的分析發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)CSBV 分離株存在序列差異［5－12］。那么，分離自不同蜜蜂種類和地理種群蜜蜂宿主的囊狀幼蟲病病毒的基因型關(guān)系如何？Grabensteiner E等［1］認(rèn)為SB14f／SB15r所擴(kuò)增序列更適合于該病毒的遺傳多樣性分析。本文利用SB14f／SB15r所擴(kuò)增的SBV RNA依賴的RNA聚合酶（RNA dependent RNA polymerase，RdRp）基因片段序列，基于系統(tǒng)進(jìn)化角度分析囊狀幼蟲病病毒的基因型關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本 采自重慶地區(qū)中蜂場(chǎng)具有典型囊狀幼蟲病特征的死幼蟲，樣本于－20℃保存。

1.1.2 序列 應(yīng)用RT－PCR擴(kuò)增自所采集的樣本，或下載自GenBank登錄的SBV序列，具體參見表1。

1.1.3 試劑 rTaqDNA聚合酶、dNTP及pMD18－T、Trizol、AMV Reverse Transcriptase、RNase inhibitor為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 RNA 的提取 取樣本浸出液50μL～100μL加Trizol至1mL，混勻后室溫靜置15min，加入250μL氯仿充分振蕩后靜置15min，在4℃以12 000r／min離心15min。取上清加入等體積異丙醇，混勻，在－20℃下靜置1h，在4℃以12 000r／min離心10min。沉淀以700mL／L乙醇洗1次，吸干上清，沉淀溶解于100μL經(jīng)DEPC處理的去離子水中，以備反轉(zhuǎn)錄。

1.2.2 RT－PCR 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：25μL體系中含有5× buffer 5μL，2.5mmol／L dNTPs 2μL，10μmol／L引物SB15r1μL，RNA 溶液15.5μL，40U／μL AMV Reverse Transcriptase 0.5 μL，10U／μL RNase Inhibitor 1μL?；旌暇鶆?，42℃水浴孵育1h合成cDNA，98℃滅活3min，置－20℃保存。

PCR反應(yīng)體系：10×PCR buffer（含15mmol／L Mg2＋）2.5μL，2.5mmol／L dNTPs 0.5μL，5U／μL rTaq0.10μL，10μmol／L 引 物SB14f和SB15r0.5μL，cDNA 0.5μL，用去離子水補(bǔ)足25μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：94℃2min；94℃30s，50℃30s，72℃ 45s，共進(jìn)行30循環(huán)；72 ℃5min；4℃終止反應(yīng)。

表1 參與分析的SBV序列Table 1Sequences of SBV used

1.2.3 條帶分析及序列測(cè)定 PCR產(chǎn)物在Gold View染色下經(jīng)10g／L瓊脂糖凝膠電泳。回收PCR目的 條 帶，將 片 段 克 隆 進(jìn) pMD18－T 載 體，用pMD18－T質(zhì)粒上的通用引物M13進(jìn)行序列測(cè)定，將序列在NCBI上作BLAST搜索以進(jìn)行同源性分析。

1.2.4 序列分析 應(yīng)用ClustalW2（http：／／www.ebi.ac.uk／Tools／msa／clustalw2／＃）進(jìn)行多序列比對(duì)分析。使用MEGA 4軟件的Bootstrap Test of Phylogeny，基于鄰接法的p－distance方法建立進(jìn)化樹，以進(jìn)行基因型分析。

2 結(jié)果

2.1 RT－PCR產(chǎn)物

使用SB14f／SB15r引物對(duì)運(yùn)用RT－PCR方法，從具有囊狀幼蟲病典型特征的病死中蜂幼蟲體中擴(kuò)增到與預(yù)期579bp大小一致的條帶（圖1）。經(jīng)序列測(cè)定及序列分析得出，所擴(kuò)增片段序列與CSBV序列同源性高于95%，與SBV同源性高于89%，與其他病原核酸序列無同源性，表明擴(kuò)增所得序列是SBV序列。

圖1 中蜂病死幼蟲的囊狀幼蟲病病毒的RT－PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Profile of RT－PCR for SBV from dead Chinese bee larvae

2.2 基因型分析

利用SB14f／SB15r引物對(duì)共擴(kuò)增到3條具有明顯變異特征的CSBV基因片段。在GenBank中下載40條包含SB14f／SB15r引物對(duì)應(yīng)區(qū)域的序列，其中有感染韓國(guó)東方蜜蜂SBV的17個(gè)序列，感染德國(guó)西蜂SBV的8個(gè)序列，使用多種構(gòu)建進(jìn)化樹的方法得到與圖2類似的基因型分化結(jié)果。本結(jié)果刪去了相似性較高的感染韓國(guó)東方蜜蜂的SBV其他16個(gè)序列及感染德國(guó)西蜂的SBV其他4個(gè)序列，是選擇代表性序列所得到的基因型分化圖。從已有的序列來看，目前SBV可分為3個(gè)基因型，即遠(yuǎn)東型、歐洲型和南非型。在遠(yuǎn)東基因型內(nèi)，存在東方蜜蜂和西蜂2個(gè)亞型，在東方蜜蜂型內(nèi)感染在中國(guó)和韓國(guó)境內(nèi)飼養(yǎng)的東方蜜蜂的SBV分屬不同的進(jìn)化群。歐洲基因型內(nèi)存在中歐和英國(guó)2個(gè)亞型。由此可見，SBV流行株總體上按地域隔離進(jìn)化，但也有例外，如德國(guó)和尼泊爾境內(nèi)的西蜂群存在遠(yuǎn)東型和歐洲型2個(gè)基因型，感染中蜂的CSBV遼寧株屬于西蜂亞型（圖2）。

圖2 SBV基因型分析Fig.2 Genotyping of Sacbrood virus

3 討論

依據(jù)SB14f／SB15r所對(duì)應(yīng)的囊狀幼蟲病病毒基因組序列，可將感染西蜂和東方蜜蜂的SBV基因型分為歐洲型、遠(yuǎn)東型和南非型3個(gè)基因型，總體上按地域分型。在遠(yuǎn)東型毒株內(nèi)存在東方蜜蜂亞型和西蜂亞型2個(gè)亞型毒株，這可能是病毒為適應(yīng)當(dāng)?shù)孛鄯渌拗髯鞒龅倪m應(yīng)性進(jìn)化［1］，也可能是病毒按地域隔離進(jìn)化的結(jié)果，進(jìn)一步驗(yàn)證需要分析感染當(dāng)?shù)仫曫B(yǎng)的東方蜜蜂和西蜂囊狀幼蟲病病毒的遺傳學(xué)特性。在尼泊爾和德國(guó)境內(nèi)飼養(yǎng)的西蜂群存在歐洲型和遠(yuǎn)東型2個(gè)基因型毒株，以及中國(guó)中蜂群存在東方蜜蜂亞型和西蜂亞型2個(gè)亞型毒株，這可能是SBV在基因型和基因亞型分化過程中保留下來的原型，暗示SBV的變異路徑。

西蜂和中蜂在生物學(xué)上存在很多差異，如中蜂可以自己清除自身的蜂螨，對(duì)蜂螨有一定抵抗性，而西蜂對(duì)蜂螨易感。蜂螨感染誘導(dǎo)西蜂和中蜂在涉及代謝過程和神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)方面基因的差異表達(dá)［12］，提供了蜂螨感染兩者的分子應(yīng)答信息，闡明了對(duì)蜂螨耐受性的分子機(jī)制。張國(guó)只［13］研究發(fā)現(xiàn)，營(yíng)養(yǎng)雜交改變了中蜂和意蜂3日齡幼蟲的蛋白質(zhì)表達(dá)譜，兩者的差異蛋白不同，CSBV感染改變了營(yíng)養(yǎng)交換了的中蜂和意蜂3日齡幼蟲的表達(dá)譜，兩者的差異蛋白也不同。由此推測(cè)，SBV感染在東方蜜蜂和西蜂所表現(xiàn)出的臨床癥狀嚴(yán)重程度可能更多地與宿主有關(guān)。

［1］Grabensteiner E，Bakonyi T，Ritter W，et al.Development of a multiplex RT－PCR for the simultaneous detection of three viruses of the honeybee（ApismelliferaL.）：acute bee paralysis virus，black queen cell virus and sacbrood virus［J］.J Invertebr Pathol，2007，94（3）：222－225.

［2］楊冠煌，杜芝蘭，張弓紹，等.中蜂囊狀幼蟲病病原鑒定［J］.中國(guó)養(yǎng)蜂，1979（5）：15－17.

［3］楊榮鑒，董秉義，范瑞蓮，等.中蜂囊狀幼蟲病病毒核酸和多肽的研究［J］.病毒學(xué)雜志，1988（1）：54－58.

［4］董秉義，袁躍東，張弓紹，等.中蜂囊狀幼蟲病血清學(xué)關(guān)系研究［J］.中國(guó)養(yǎng)蜂，1984（3）：8－9.

［5］許益鵬，章奕卿，李江紅，等.蜜蜂囊狀幼蟲病毒病的Nest－PCR檢測(cè)［J］.科技通報(bào)，2007，23（6）：824－827.

［6］李 明，馬嗚瀟，張軼博，等.遼寧地區(qū)中華蜜蜂囊狀幼蟲病的 RT－PCR檢測(cè)［J］.畜牧獸醫(yī)科技信息，2008（12）：26－27.

［7］沈克飛，曹 蘭，付利芝，等.中蜂囊狀幼蟲病病毒特異性半套式RT－PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009，30（12）：39－42.

［8］董欣妮，史平軍，付長(zhǎng)紅，等.遼西地區(qū)中華蜜蜂囊狀幼蟲病病毒部分結(jié)構(gòu)基因的克隆及分析［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2010，（3）：114－116.

［9］周 亮，宋戰(zhàn)昀，王全凱，等.蜜蜂囊狀幼蟲病RT－PCR快速檢測(cè)方法的初步應(yīng)用［J］.蜜蜂雜志，2010，30（6）：9－10.

［10］馬嗚瀟，李 明，袁春穎，等.蜜蜂囊狀幼蟲病RNA依賴的RNA聚合酶部分基因的克隆和序列分析［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2010，37（11）：50－52.

［11］Ma M，Ma C，Li M，Wang S，et al.Loop－mediated isothermal amplification for rapid detection of Chinese sacbrood virus［J］.J Virol Meth，2011，176（1－2）：115－119.

［12］Zhang Y，Liu X，Zhang W，et al.Differential gene expression of the honey beesApismelliferaandA.ceranainduced by Varroa destructor infection［J］.J Insect Physiol，2010，56（9）：1207－1218.

［13］張國(guó)只.中華蜜蜂中腸細(xì)胞培養(yǎng)及CSBV感染中華蜜蜂和意大利蜜蜂幼蟲的蛋白質(zhì)組分析［D］.廣東廣州：中山大學(xué)，2009.