高 艷，占日新，劉麗麗，陳芳輝，李宙雪，張 盈，孔 瀅，黃起壬

(南昌大學(xué)藥學(xué)系藥理學(xué)與分子治療學(xué)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌 330006)

過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)是一類由配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，屬于核受體超家族成員，包括3種亞型:PPARα、PPARβ 和 PPARγ［1］。其中 PPARγ 與脂肪細(xì)胞分化、胰島素抵抗、能量代謝和胰島素的敏感性密切相關(guān)，表達(dá)于成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、乳腺細(xì)胞、脾臟的紅白髓質(zhì)、骨髓前體細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞、肺泡及氣道上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞中［2－3］。關(guān)于PPARγ改善機(jī)體胰島素敏感性的機(jī)制研究，一直是人們關(guān)注的熱點(diǎn)之一。美國加州大學(xué)和瑞士洛桑聯(lián)邦理工學(xué)院的研究表明，敲除實(shí)驗(yàn)鼠脂肪細(xì)胞內(nèi)核受體共抑制因子(NCoR)可改善胰島素敏感性。NCoR存在于很多細(xì)胞中，是轉(zhuǎn)錄因子輔助調(diào)節(jié)蛋白，是主要的PPARγ的共抑制因子。敲除實(shí)驗(yàn)鼠脂肪細(xì)胞內(nèi)NCoR后，PPARγ磷酸化受阻，最后導(dǎo)致肝臟、肌肉和脂肪胰島素敏感性增加［4－5］。本實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建針對PPARγ基因的短發(fā)夾環(huán)狀小干擾RNA(shRNA)重組載體，并將其轉(zhuǎn)染到人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)，篩選出抑制效果最好的重組表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究PPARγ低表達(dá)對高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮胰島素抵抗及其敏感性的作用及機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1質(zhì)粒、菌種與細(xì)胞株pGPU6/GFP/Neo質(zhì)粒購自上海吉瑪公司;脂質(zhì)體為LipofectamineTM2000;人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株購自ATCC。

1.2工具酶及主要試劑限制性內(nèi)切酶BbsⅠ和BamHⅠ購自美國NEB公司;限制性內(nèi)切酶PstⅠ購自Promega公司;T4連接酶和DNA Marker購自TaKaRa公司;質(zhì)粒小提試劑盒和DNA膠回收純化試劑盒購自Qiagen公司;Top10感受態(tài)細(xì)胞購自天根公司;DMEM培養(yǎng)基干粉購自Invitrogen公司;特級胎牛血清購自杭州四季青生物制品公司;Kanamycin購自Sigma公司;PPARγ多克隆抗體及HRP標(biāo)記的二抗購自Cell Signaling公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司。

1.3引物設(shè)計及合成利用GenBank檢索人PPARγ mRNA系列(GenBank Accession:NM_138712)，根據(jù)siRNA設(shè)計原則，通過Ambion公司在線設(shè)計軟件輔助設(shè)計，使用Blast將選定的序列進(jìn)行同源性分析，最后選出3條片段作為PPARγ基因干擾片段，設(shè)計shRNA模板中的 loop結(jié)構(gòu)選用了TTCAAGAGA以避免形成終止信號，shRNA的轉(zhuǎn)錄終止序列采用TTTTTT結(jié)構(gòu)。正義鏈模板的5'端添加了CACC與BbsⅠ酶切后形成的黏端互補(bǔ);反義鏈模板的5'端添加了GATC與BamHⅠ酶切后形成的黏端互補(bǔ);如果siRNA的第1個堿基不是G，則在CACC后補(bǔ)加個G。將合成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)寡核苷酸單鏈用無核酶水稀釋為濃度0.46 mmol·L－1。按照以下體系退火得到shRNA模板:1 μl正義鏈、1 μl反義鏈、48 μl TE(pH 8.0)共50 μl在PCR儀上按照如下程序進(jìn)行退火處理:90 ℃ 4 min，80 ℃ 4 min，75 ℃ 4 min，70 ℃ 10 min，37℃ 20 min，10℃ 40 min，4℃保存。將退火后產(chǎn)物稀釋20倍，終濃度為 0.92 μmol·L－1用于連接反應(yīng)。

1.4酶切和連接反應(yīng)pGPU6/GFP/Neo載體按如下反應(yīng)體系進(jìn)行雙酶切:10 × NEB buffer 2 μl、100 × BSA 0.2 μl、pGPU6/GFP/Neo 1 μg、Bbs Ⅰ 0.8 μl、Bam HⅠ 0.5 μl、加無核酶水至20 μl，37℃酶切3 h。1%TAE瓊脂糖凝膠電泳，使用凝膠回收試劑盒回收。將退火片段與經(jīng)雙酶切后的載體按摩爾比4∶1進(jìn)行連接反應(yīng)，置16℃連接16 h。

1.5重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、篩選和鑒定將連接產(chǎn)物接種于Top10感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，涂布到3 ml含Kanamycin(終濃度為4.62 μmol·L－1)的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃恒溫箱培養(yǎng)過夜，各挑取2個菌落，接種到含4.62 μmol·L－1Kanamycin的LB液體培養(yǎng)基中搖菌過夜。用質(zhì)粒小提試劑盒抽提質(zhì)粒，所得質(zhì)粒用PstⅠ和BamHⅠ分別酶切鑒定。得到的重組質(zhì)粒分別命名pGPU6/GFP/Neo-shRNAPPARγ1，2，3。將初步鑒定證實(shí)的細(xì)菌擴(kuò)增培養(yǎng)，取1 ml菌液送天根生化科技(北京)有限公司進(jìn)行測序鑒定，測序引物為T7，測序方向?yàn)檎驕y序。

1.6重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HUVECs取處于對數(shù)生長期的HUVECs，用胰酶消化后使用含血清和不含抗生素的正常培養(yǎng)基重懸為2×108～8×108個·L－1后，接種至6孔培養(yǎng)板上，待細(xì)胞生長至70% ～80%匯合時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。LipofectamineTM2000試劑和質(zhì)粒比例為 10 μl∶4 μg，按照轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，6 h后換成高糖培養(yǎng)基(33 mmol·L－1)。轉(zhuǎn)染24 h時后熒光顯微鏡下觀察HUVECs綠色熒光的表達(dá)情況，觀察質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率。實(shí)驗(yàn)分為空白對照組(Control組)、高糖組(IR組)、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(IR+Non-silencing shRNA組)和重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(IR+shRNAPPARγ 1，2，3 組)，每組重復(fù)3次。

1.7Western blot檢測PPARγ基因的蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)染48 h后提取HUVECs總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度。上樣量為40μg，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，PVDF膜印跡，室溫10%脫脂牛奶封閉2 h，加入PPARγ一抗(1∶500)孵育過夜，辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記的二抗孵育2 h，ECL化學(xué)發(fā)光顯色，X線片顯影、定影。ImageTool圖像分析軟件測定各條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參照進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計算抑制率，抑制率/%=(對照組－干擾組)/對照組×100%。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS16.0統(tǒng)計分析軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，所得數(shù)值以±s表示。

2 結(jié)果

2.1引物設(shè)計及合成根據(jù)siRNA設(shè)計原則，通過Ambion公司在線設(shè)計軟件輔助設(shè)計3條片段作為PPARγ基因干擾片段(Tab 1)，由寶生物工程(大連)有限公司合成。

Tab 1 Design there shRNA sequence for the synthesis of PPARγ gene

2.2重組質(zhì)粒酶切鑒定用PstⅠ和BamHI分別酶切重組載體，質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo的BamHⅠ和BbsⅠ酶切位點(diǎn)之間是PstⅠ的酶切位點(diǎn);插入目的基因干擾片段之后，PstⅠ酶切位點(diǎn)被取代，故不能被PstⅠ所酶切，但可被BamHⅠ酶切開，條帶在5 100 bp左右(Fig 1)。

Fig 1 Restriction enzyme analysis of recombinant plasmid pGPU6/GFP/Neo

2.3重組質(zhì)粒測序鑒定將篩選克隆送天根生化科技(北京)有限公司測序，結(jié)果顯示重組質(zhì)粒測序鑒定shRNA編碼序列與設(shè)計的片段完全一致，表明載體構(gòu)建成功(Fig 2)。

Fig 2 The sequencing result of recombinant plasmid of pGPU6/GFP/Neo-PPARγ-1，2，3

2.4重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率因?yàn)楦蓴_質(zhì)粒帶有EGFP片段，進(jìn)入細(xì)胞后可以產(chǎn)生能被激發(fā)出綠色熒光的蛋白，所以可以據(jù)此判斷轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染效率/%=發(fā)出綠色熒光的細(xì)胞個數(shù)/明場中總細(xì)胞個數(shù)×100%，轉(zhuǎn)染效率為45%(Fig 3)。

Fig 3 Fluorescence microscope restructuring recombinant plasmid transfected HUVECs(×100)

2.5重組質(zhì)粒中PPARγ蛋白的表達(dá)Western blot檢測結(jié)果顯示(Fig 4)，IR組與Control組相比差異具有顯著性(P＜0.01);IR組和Non-silencing shRNA組間相比無差異(P＞0.05);shRNAPPARγ1和shRNAPPARγ2組與IR組相比無差異(P＞0.05)，無干擾效應(yīng);shRNAPPARγ3組與IR組相比差異有顯著性(P＜0.05)，說明轉(zhuǎn)入 PPARγshRNAPPARγ3后，抑制了PPARγ基因的表達(dá)，使PPARγ蛋白在高糖誘導(dǎo)下轉(zhuǎn)錄生成減少。

Fig 4 Western blot control to detect the expression of PPARγ protein

3 討論

過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARγ)是類固醇/甲狀腺素核受體超家族成員之一，與NF-κB及活化劑蛋白-1(AP-1)等因子關(guān)系密切［6－7］。PPARγ可在體內(nèi)體外調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞分化，在脂肪形成、糖脂代謝及免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，并且與糖尿病、肥胖、高血壓、癌癥等的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但是在血管內(nèi)皮細(xì)胞中PPARγ對胰島素抵抗的作用機(jī)制還未完全闡明。

胰島素抵抗是指胰島素的靶器官對生理濃度的胰島素反應(yīng)減弱，是2型糖尿病的重要發(fā)病因素。胰島素抵抗是代謝綜合征的中心環(huán)節(jié)，PPARγ對糖代謝的調(diào)節(jié)主要是增加外周組織對胰島素的敏感性，從而改善胰島素抵抗［8］。有研究表明［9］，PPARγ功能受損會導(dǎo)致嚴(yán)重的胰島素抵抗，而合成的PPARγ激動劑噻唑烷二酮類藥物包括曲格列酮(troglitazone)、羅格列酮、吡格列酮可以有效改善2型糖尿病患者的胰島素敏感性并降低血糖。PPARγ增加胰島素敏感性的機(jī)制可能是:磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)是靶細(xì)胞介導(dǎo)葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵性激酶，PPARγ在PI3K信號通路中可以促進(jìn)PI3K基因表達(dá)，增強(qiáng)胰島素的敏感性，還可增強(qiáng)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4(GluT4)基因表達(dá)，促進(jìn)對葡萄糖的攝?。?0］;PPARγ活化可以加速甘油三酯在外周組織的分解和抑制轉(zhuǎn)錄因子Pax6的活性，抑制胰高血糖素的生成和表達(dá)，改善胰島素抵抗［11］。

RNAi技術(shù)具有快速、高效、便于操作等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用到基因功能研究、基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究等熱門領(lǐng)域［12］。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用RNAi技術(shù)，成功構(gòu)建了PPARγ低表達(dá)質(zhì)粒，并成功篩選出了沉默效果最好的重組表達(dá)載體。為進(jìn)一步研究PPARγ低表達(dá)對高糖誘導(dǎo)胰島素抵抗及其敏感性的作用及機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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