朱曉冉，東 蕾，許彥芳

(教育部神經(jīng)血管生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北省新藥藥理毒理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，河北石家莊 050017)

心肌細(xì)胞膜上的離子通道是維持心臟正常電活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，其結(jié)構(gòu)和(或)功能的異常稱(chēng)心臟離子通道病(cardiac channelopathies)［1］，包括基因突變所致的遺傳性離子通道病和后天獲得性離子通道病，后者見(jiàn)于疾病引發(fā)的通道功能改變、藥物抑制心肌通道等。通道功能紊亂常引發(fā)心律失常，嚴(yán)重者可致心源性猝死［1］。因此研究心臟離子通道正常生理功能調(diào)節(jié)和病理變化具有重要的意義。

參與心室動(dòng)作電位復(fù)極化的鉀電流主要包括瞬時(shí)外向鉀電流(Ito)、延遲整流鉀電流(IK)及內(nèi)向整流鉀電流(IK1)等［2］。Ito是小動(dòng)物，如小鼠、大鼠心室肌細(xì)胞主要的復(fù)極電流，IK是包括人類(lèi)在內(nèi)的大動(dòng)物心室復(fù)極化的主要電流，按照通道動(dòng)力學(xué)的不同將其區(qū)分為快激活(IKr)和慢激活成分(IKs)。豚鼠心室動(dòng)作電位及其離子通道與人類(lèi)具有相似性［3］，是目前研究IKr和IKs的常用動(dòng)物。研究表明，心肌多種鉀電流從出生到成年的發(fā)育過(guò)程存在明顯變化，然而關(guān)于豚鼠在幼年至成年的發(fā)育過(guò)程中心室肌細(xì)胞IKr和IKs兩種成分的變化尚未見(jiàn)報(bào)道。因此本研究采用膜片鉗技術(shù)，觀察延遲整流鉀電流IKr、IKs以及動(dòng)作電位在豚鼠從新生、幼年到成年發(fā)育過(guò)程中的變化規(guī)律，為相關(guān)研究提供背景資料。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物及分組清潔級(jí)Hartley♂豚鼠，河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，新生豚鼠為出生后1～2 d，體質(zhì)量50～80 g;幼年豚鼠出生后2周，體質(zhì)量90～120 g;成年豚鼠約3個(gè)月，體質(zhì)量250～350 g。

1.2心室細(xì)胞急性分離豚鼠心室細(xì)胞分離參照文獻(xiàn)方法進(jìn)行［4］。先腹腔注射肝素2 000 U·kg－1后，戊巴比妥鈉(0.1 g·kg－1)腹腔注射麻醉。迅速取下心臟，經(jīng)主動(dòng)脈進(jìn)行Langendorff逆行灌流。調(diào)整灌流速度使新生、幼年及成年心臟分別為2.5、4.5和7 ml·min－1。在37℃下用100%O2飽和的無(wú)鈣臺(tái)氏液灌流約5 min。臺(tái)氏液組成(mmol·L－1):NaCl 140、KCl 5.4、MgCl21、Glucose 10、HEPES 10(用NaOH調(diào)pH值至7.4)，之后用含0.4 g·L－1Ⅱ型膠原酶(Gibco公司)的無(wú)鈣臺(tái)氏液循環(huán)灌流5～15 min，當(dāng)心臟變得柔軟、松弛時(shí)用無(wú)鈣臺(tái)氏液沖洗5 min以終止反應(yīng)，取下心臟。取左心室游離壁中層細(xì)胞保存于KB液中。KB液組成(mmol·L－1):KOH 80、KCl 40、KH2PO425、MgSO43、L-glutamic acid 50、taurine 20、EGTA1、Glucose 10、HEPES 10(用KOH調(diào)pH值至7.2)。細(xì)胞分離后6～8 h內(nèi)用于電生理記錄。

1.3電生理記錄

1.3.1電流的記錄采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)室溫(23℃ ～25℃)下記錄不同年齡段豚鼠心肌細(xì)胞的延遲整流鉀電流。細(xì)胞外液組成(mmol·L－1):NaCl 132、KCl 4、MgCl21.2、CaCl21.8、Glocose 5、HEPES 10(用NaOH調(diào)pH值至7.4)，電極內(nèi)液組成(mmol·L-1):KCl 140、Mg-ATP 4、MgCl21、EGTA 5、HEPES 10(用KOH調(diào)pH值至7.2)。向外液中加入尼莫地平(Nim，1 μmol·L－1)，阻斷 L-型Ca2+通道，保持膜電位在－40 mV，使Na+通道和T-型Ca2+通道失活。在電壓鉗模式下，首先從－40 mV開(kāi)始以階躍電壓10 mV的方式去極化到+50 mV，維持3 000 ms，而后保持 －40 mV 2 000 ms引出尾電流(IK-tail)，隨后給予 2 μmol·L－1E-4031，特異性阻斷IKr，記錄IKs。用IK-tail-IKs-tail計(jì)算IK的快激活成分(IKr)的大小。以鉗制電壓為－50 mV，超級(jí)化－10 mV得到的細(xì)胞電容電流積分值，計(jì)算出細(xì)胞電容，求得電流密度(pA/pF)。

1.3.2動(dòng)作電位的記錄采用打孔膜片鉗技術(shù)記錄各年齡段豚鼠心室肌細(xì)胞的動(dòng)作電位。細(xì)胞外液組成(mmol·L－1):NaCl 138、KCl 4、MgCl21、CaCl22、NaH2PO40.33、glucose 10、HEPES 10(用 NaOH 調(diào)pH值至7.4)，電極內(nèi)液組成(mmol·L－1):谷氨酸鉀 120、KCl 25、MgCl21、CaCl21、HEPES 10(用NaOH調(diào)pH值至7.4)。先用電極尖部充以少量不含兩性霉素的電極內(nèi)液，再用含兩性霉素(終濃度600 μg·L－1)的電極內(nèi)液充灌電極，用微電極操縱器將電極推向細(xì)胞，負(fù)壓吸引形成高阻封接，5～10 min后轉(zhuǎn)到電流鉗下，細(xì)胞予以波寬10 ms，1Hz的方波，100% ～120%閾電流誘導(dǎo)動(dòng)作電位，靜息膜電位達(dá)不到－70 mV的細(xì)胞棄去不用。測(cè)量動(dòng)作電位參數(shù)，包括靜息電位、動(dòng)作電位幅值、復(fù)極化90%需要的時(shí)間(APD90)等。

上述電生理數(shù)據(jù)的采集均在美國(guó)Axon公司的Axonpatch 200B放大器上由pClamp 8.1軟件通過(guò)Digidata 1322A數(shù)模轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換完成。玻璃微電極由Sutter公司的Model P-97型電極拉制器通過(guò)六步法拉制而成。電極拋光后，充灌電極內(nèi)液，控制電阻在2～4 MΩ之間。實(shí)驗(yàn)在室溫(20℃ ～25℃)下進(jìn)行。

1.4試劑配制除特殊標(biāo)注外，實(shí)驗(yàn)中所用試劑均為Sigma公司產(chǎn)品。Chromanol 293B溶于DMSO配制成 10 mmol·L－1的儲(chǔ)備液，儲(chǔ)存于 －20℃;E-4031溶于水配制成1 mmol·L－1的儲(chǔ)備液，儲(chǔ)存于－20℃;Nimodipine溶于DMSO配制成100 mmol·L－1的儲(chǔ)備液，避光保存。

1.5數(shù)據(jù)處理采用Clampfit 9.0(美國(guó) Axon公司)和Origin 7.5(美國(guó)Origin Lab公司)軟件進(jìn)行圖像處理及數(shù)據(jù)分析。所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果用±s表示，采用單因素方差分析(ANOVA)比較組間的顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1發(fā)育過(guò)程中心室肌細(xì)胞IK的變化如Fig 1所示，豚鼠在新生、幼年及成年3個(gè)階段的發(fā)育過(guò)程中，延遲整流鉀電流IK的電流密度呈明顯遞增式變化，幼年組在－20～+50 mV范圍內(nèi)高于新生組(P＜0.01);成年組在－0～+50 mV范圍內(nèi)高于幼年組(P＜0.01)。

Fig 1 Current-voltage relationship for the IKtail current in neonatal(squares)，young(circles)and adult(triangles)guinea pig ventricular myocytes(n=8/8)(myocytes/guinea-pigs)

2.2發(fā)育過(guò)程中心室肌細(xì)胞IKs的變化區(qū)分延遲整流鉀電流兩種成分可以通過(guò)區(qū)分通道動(dòng)力學(xué)差別或通過(guò)使用通道特異性阻斷劑的方法，近年的研究中多采用后者［4］。通過(guò)依次加入IKr、IKs特異阻斷劑，理論上應(yīng)該全部阻斷IK才能證明用阻斷劑區(qū)分兩種電流成分的可靠性。為此，我們依次加入2 μmol·L－1E-4031 和30 μmol·L－1chromanol 293B，記錄電流阻斷情況。如Fig 2所示，IK在依次加入兩種阻斷劑后可被完全阻斷，表明記錄方法的可靠性。故加入IKr特異阻斷劑E-4031后剩余的成分即為IKs。比較新生、幼年及成年3個(gè)階段IKs的電流密度可見(jiàn)(Fig 3)，幼年動(dòng)物在－30～+50 mV較新生動(dòng)物明顯增加(P＜0.05或＜0.01)，成年動(dòng)物又較幼年明顯增長(zhǎng)(－10～+50 mV，P＜0.01)。

2.3發(fā)育過(guò)程中心室肌細(xì)胞IKr的變化與新生動(dòng)物相比，幼年動(dòng)物的IKr在去極化電壓－10 mV～+50 mV范圍內(nèi)呈明顯增加(P＜0.01)。而幼年與成年相比，IKr的電流密度未見(jiàn)明顯改變(P＞0.05)。

2.4發(fā)育過(guò)程中心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位的變化在1 Hz的刺激頻率下，新生、幼年及成年豚鼠心室肌細(xì)胞靜息電位分別為(－80.1±1.5)、(－81.6±1.8)及(－78.9±1.3)mV(組間比較無(wú)明顯差別，P＞0.05);動(dòng)作電位幅值分別為(127.9±2.1)、(129.3±3.0)及(131.7±2.5)mV(組間比較無(wú)明顯差別，P＞0.05);APD90分別為(159.7±9.8)、(188.4±14.3)及(203.8±12.8)ms，幼年組較新生組明顯延長(zhǎng)(P＜0.01)，而成年又較幼年明顯延長(zhǎng)(P＜0.01)(Fig 5)?？梢?jiàn)，豚鼠在發(fā)育過(guò)程中心室肌細(xì)胞靜息電位和動(dòng)作電位幅值未見(jiàn)明顯改變，而APD90隨年齡的增長(zhǎng)逐漸延長(zhǎng)。

Fig 2 Original current recordings in ventricular myocytes from neonatal，young and adult guinea pigs

Fig 3 Current-voltage relationship for the IKstail current in neonatal(squares)，young(circles)and adult(triangles)guinea pig ventricular myocytes(n=8/8)(myocytes/guinea-pigs)

3 討論

心室復(fù)極化的各種鉀電流存在明顯種屬差異，由于嚙齒類(lèi)動(dòng)物心肌細(xì)胞缺乏或具極少量的IKr和IKs，故豚鼠是目前研究延遲整流鉀電流的常用動(dòng)物，但不同年齡發(fā)育階段延遲整流鉀電流和動(dòng)作電位的變化情況目前尚不明確。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，豚鼠心室肌細(xì)胞延遲整流鉀電流從新生、幼年到成年呈逐漸增加趨勢(shì)。先前Kato等［5］曾報(bào)道，豚鼠心室肌細(xì)胞IK從胚胎、新生至成年發(fā)育過(guò)程中呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。區(qū)分IKr和IKs兩種成份顯示，盡管IKr和IKs均隨動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育電流密度呈逐漸增加趨勢(shì)，但它們的變化方式不同，其中IKr在幼年階段即發(fā)育至成年水平，而IKs則從新生、幼年直至成年持續(xù)發(fā)育。以往的研究表明［6－7］，Ito在小動(dòng)物伴隨動(dòng)物出生后的發(fā)育過(guò)程明顯增大。主要維持動(dòng)物靜息電位的IK1，在小鼠［6］，大鼠［7］和家兔［8］從胚胎期到成年的發(fā)育過(guò)程中電流密度也不斷增大。新生1 d的小鼠心室肌可記錄到IKr和IKs，3 d時(shí)IKs明顯增大，發(fā)育至成年后幾乎記錄不到IKr和IKs［9］。另有報(bào)道，新生犬心室肌細(xì)胞缺乏IKs［10］。上述的結(jié)果表明，不同的復(fù)極K+電流從新生至成年存在明顯不同的發(fā)育模式和種屬差異。

Fig 4 Current-voltage relationship for the IKrtail current in neonatal(squares)，young(circles)and adult(triangles)guinea pig ventricular myocytes(n=8/8)(myocytes/guinea-pigs)

Fig 5 Action potential recordings from neonatal，young and adult guinea pig ventricular myocytes driven at a constant frequency of 1 Hz under current clamp mode

心肌細(xì)胞的動(dòng)作電位時(shí)程和形態(tài)取決于各種去極化內(nèi)向電流和復(fù)極化外向電流之間的精細(xì)平衡。為說(shuō)明上述發(fā)育過(guò)程中鉀電流變化對(duì)APD的影響，本實(shí)驗(yàn)采用打孔膜片鉗記錄方式記錄了不同發(fā)育階段豚鼠心室細(xì)胞的動(dòng)作電位。打孔膜片可以盡可能保持細(xì)胞內(nèi)容物，使記錄更接近于生理狀態(tài)。結(jié)果表明，從出生到成年豚鼠心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位幅值和靜息膜電位并沒(méi)有明顯的改變，而動(dòng)作電位時(shí)程(APD90)隨動(dòng)物的發(fā)育過(guò)程逐漸延長(zhǎng)。這與先前Agata用玻璃微電極技術(shù)記錄到的結(jié)果一致［11］。盡管在其他動(dòng)物發(fā)育中IK1逐漸增長(zhǎng)［6－8］，確有人發(fā)現(xiàn)新生和成年豚鼠心室細(xì)胞IK1的電流密度沒(méi)有明顯差別［5］，這與本實(shí)驗(yàn)觀察到的靜息電位無(wú)明顯變化相一致。此外，在對(duì)清醒豚鼠心電圖的研究中也發(fā)現(xiàn)，成年組動(dòng)物的QT和RR間期較幼年組明顯延長(zhǎng)［12］。由于豚鼠心肌細(xì)胞缺乏Ito，因此影響豚鼠心室肌細(xì)胞復(fù)極化的鉀電流主要是延遲整流鉀電流。顯然這種動(dòng)作電位時(shí)程的延長(zhǎng)是一種與外向鉀電流平衡的內(nèi)向電流逐漸增強(qiáng)所造成。確有報(bào)道，成年豚鼠心室肌細(xì)胞中L-型鈣電流的電流密度明顯高于幼年豚鼠［5］，提示豚鼠心室發(fā)育過(guò)程中APD的逐漸延長(zhǎng)主要因L-型鈣電流的增加所致。

目前，豚鼠心臟是研究IKr和IKs的常用動(dòng)物，特別是近年在藥物影響心臟復(fù)極潛在致心律失常風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)中［13］，上述關(guān)于IKr、IKs以及動(dòng)作電位隨發(fā)育改變的實(shí)驗(yàn)結(jié)果將為研究豚鼠電生理提供重要背景資料。

［1］Marban E.Cardiac channelopathies［J］.Nature，2002，415(6868):213－8.

［2］Roden D M，Balser J R，George A L，Anderson M E.Cardiac ion channels［J］.Annu Rev Physiol，2002，64:431 －75.

［3］Sakaguchi Y，Takahara A，Nakamura Y，et al.Halothane-anaestheized，closed-chest，guinea-pig model for assessment of drug-induced QT-interval prolongation［J］.Basic Clin Pharmacol Toxicol，2009，104(1):43－8.

［4］Wang Y H，Shi C X，Dong F，et al.Inhibition of the rapid component of the delayed rectifier potassium current in ventricular myocytes by angiotensin Ⅱ via the AT1 receptor［J］.Br J Pharmacol，2008，154(2):429 －39.

［5］Kato Y，Masumiya H，Agata N，et al.Developmental changes in action potential and membrane currents in fetal，neonatal and adult guinea-pig ventricular myocytes［J］.J Mol Cell Cardiol，1996，28(7):1515－22.

［6］Grandy S A，Trepanier-Boulay V，F(xiàn)iset C.Postnatal development has a marked effect on ventricular repolarization in mice［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2007，293(4):H2168 －77.

［7］Masudah，Sperelakis N.Inwardly rectifying potassium current in rat fetal and neonatal ventricular cardiomyocytes［J］.Am J Physiol，1993，265(4):H1107 －11.

［8］Huynh T V，Chen F，Wetzel G T，et al.Developmental change in membrane Ca2+and K+current in fetal，neonatal and adult rabbit ventricular myocytes［J］.Circ Res，1992，70(3):508 － 15.

［9］Wang L，F(xiàn)eng Z P，Kondo C S，et al.Development changes in the delayed rectifier K+channels in mouse heart［J］.Circ Res，1996，79(1):79－85.

［10］ObreztchIKova M N，Sosunov E A，PlotnIKov A，et al.Development changes inIKrandIKscontribute to age-related expression of dofeilide effects on repolarization and proarrhythmia［J］.Cardiovasc Res，2003，59(2):339 －50.

［11］Agata N，Tanaka H，Shigenobu K.Developmental changes in action potential properties of guinea-pig myocardium［J］.Acta Physiol Scand，1993，149(3):331－7.

［12］Shiotani M，Harada T，Abe J，et al.Aging-related changes of QT and RR intervals in conscious guinea pigs［J］.J Pharmacol Toxicol Methods，2008，57(1):23 －9.

［13］韓圣娜，陳 秋，張 雨，等.氟康唑?qū)﹄嗍笮氖壹〖?xì)胞IK和在HEK-293細(xì)胞中表達(dá)的HERG鉀通道的抑制作用［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2010，26(7):861－6.

［13］Han S N，Chen Q，Zhang Y，et al.Inhibition of delayed rectifier K+current in guinea pig ventricular myocytes and HERG K+channel expressed in HEK-293 cells by fluconazole［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(7):861－6.