李佳佳，楊 竹，2，王應(yīng)雄，于 超

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院，重慶 400016;2.重慶醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，重慶 400010)

動脈粥樣硬化形成的始動環(huán)節(jié)之一是血管內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷。而這種損傷又可能與高血壓、糖尿病血管并發(fā)癥等眾多心腦血管疾病有著密切的聯(lián)系［1－2］。IL-1β是白細(xì)胞介素1細(xì)胞因子家族的成員之一，是最重要的炎癥細(xì)胞因子之一，它介導(dǎo)了炎癥的重要過程，已有研究顯示IL-1β可以導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂［3－4］。認(rèn)清這種細(xì)胞功能紊亂的機(jī)制，將會為動脈粥樣硬化的形成機(jī)制提供較好的理論依據(jù)。

整合素(integrin)是一類重要的細(xì)胞表面受體家族，由α和β兩個亞基組成，α和β亞基均由長的胞外區(qū)、跨膜區(qū)和短的胞內(nèi)區(qū)組成，通過與細(xì)胞外基質(zhì)，如纖連蛋白、膠原蛋白、層粘連蛋白等黏附，在介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的黏附、淋巴細(xì)胞運(yùn)輸、腫瘤生長及感染等方面發(fā)揮重要的作用［5－6］。有研究顯示整合素β1與纖連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)結(jié)合，不僅調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附和遷移，而且調(diào)控細(xì)胞的分化與凋亡［7－8］。β1整合素的過表達(dá)可以抑制介導(dǎo)的生存信號，并能夠抵抗順鉑誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌的發(fā)展［9］。也有研究發(fā)現(xiàn)生長在有β1整合素的特異性配體FN上的卵巢癌細(xì)胞對順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用的敏感性下降［10］。以往的研究證實(shí)N-糖基化作用是整合素發(fā)揮作用必不可少的。本文旨在探討β1整合素的N-糖基化作用與內(nèi)皮細(xì)胞損傷之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司;生長因子HAT購自Sigma公司;白細(xì)胞介素1β(IL-1β)購自 Prospec-Tany Technogene公司;蛋白裂解液及抗 β-actin，抗-Bcl-2，抗-Bax，抗-Caspase-3抗體購自 CST公司;抗 β1-integrin購自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA，USA)公司。phytohemagglutinm lectin(L4-PHA)購自Vector lab公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理EA.hy926人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，以含10% 滅活胎牛血清、30 mg·L－1HAT生長因子添加物、1×105U·L－1青霉素、100 mg·L－1鏈霉素的 RPMI1640培養(yǎng)基，在 37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。0.125% 胰酶消化傳代。待細(xì)胞生長到對數(shù)生長期后，取一定數(shù)量的細(xì)胞接種于培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)12 h后，改加含不同濃度的IL-1β(1、5、25 μg·L－1)的培養(yǎng)液處理24 h，空白對照組僅加入相同體積的培養(yǎng)液，進(jìn)行相應(yīng)細(xì)胞學(xué)檢測。

1.2.2Western blot、Lectin blot、Immunoprecipitation分析收集前述處理后的細(xì)胞，加入CST裂解液(含10%Ser/Thr抑制劑，10%Tyr抑制劑，10%PMSF)裂解細(xì)胞，于12，000×g，4℃ 離心 15 min，收集上清液，加入5×蛋白質(zhì)上樣緩沖液，沸水中沸煮10 min。經(jīng) SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至 PVDF膜。用5% 脫脂奶粉封閉1 h，4℃過夜孵育一抗(Bcl-2、Bax、β1-integrin、Caspase-3、β-actin 抗體)或者凝集素L4-PHA，用TBST漂洗3次，再與相應(yīng)辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗或卵白素室溫孵育1 h。ECL化學(xué)發(fā)光法顯影，在ChemDoc成像儀(Bio-Rad，USA)分析結(jié)果。對于免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，1.5 mg的全細(xì)胞蛋白裂解液與3 μl β1-integrin抗體共同4℃過夜孵育，再加入 20 μl Protein G beads 4℃孵育 120 min。孵育過后，用細(xì)胞裂解液洗3次。將上述處理過的裂解液重復(fù)Western blot步驟。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡收集一定數(shù)量細(xì)胞，加入5 μl標(biāo)記有異硫氰酸熒光素(FITC)的膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)，再加入2 μl PI，充分混勻，避光37℃ 水浴溫育15 min，最后加入400 μl緩沖液測定細(xì)胞凋亡。

1.2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法每批試驗(yàn)至少重復(fù)3次，每組至少3個復(fù)孔，數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS11.0軟件分析，兩組間差異用Student’st檢驗(yàn)分析，多組間比較用方差分析法處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1IL-1β誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡為考察IL-1β對內(nèi)皮細(xì)胞是否具有損傷作用，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。結(jié)果如Fig 1所示，空白對照組EA.hy926細(xì)胞的凋亡率為 0.84%，不同濃度 IL-1β(1、5、25 μg·L－1)處理 24 h后，則細(xì)胞凋亡率變?yōu)?1.35%、3.95%、6.81%(P＜0.05)。表明IL-1β可以抑制誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

2.2白細(xì)胞介素1β抑制β1整合素的表達(dá)為了探討IL-1β對于β1整合素及細(xì)胞凋亡的相關(guān)通路的影響，采用Western blot的方法對β1-integrin表達(dá)進(jìn)行分析。結(jié)果如Fig 2所示，與對照組相比，當(dāng)不同濃度 IL-1β(1、5、25 μg·L－1)處理24 h 后，β1-integrin明顯降低(P＜0.05)。

2.3白細(xì)胞介素1β誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)采用Western blot的方法對 Bcl-2、Bax和 Caspase-3表達(dá)進(jìn)行分析。結(jié)果如Fig 3所示，細(xì)胞不同濃度IL-1β(1、5、25 μg·L－1)處理 24 h 后，與對照組相比Bax蛋白表達(dá)水平明顯升高，Bcl-2的表達(dá)明顯被抑制。而下游的細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3的表達(dá)水平也明顯升高(P＜0.05)。結(jié)果提示，IL-1β可能通過膜上β1整合素的變化，進(jìn)而調(diào)節(jié)線粒體膜上Bcl-2/Bax比值的改變，經(jīng)一系列級聯(lián)作用引起凋亡蛋白Caspase-3活性的改變，從而誘發(fā)細(xì)胞凋亡。

Fig 1 EA.hy926 cell apoptosis induced by IL-1β

Fig 2 Effects of IL-1β on β1-integrin in EA.hy926 cells

Fig 3 Effects of IL-1β on Bax，Bcl-2 and Caspase-3 in EA.hy926 cells

2.4IL-1β抑制EA.hy926細(xì)胞β1-6GlcNAc糖支鏈以及其所修飾的β1整合素的量為了驗(yàn)證IL-1β是否對細(xì)胞內(nèi)β1-6GlcNAc糖支鏈有影響，采用Western blot及Lectin blot方法進(jìn)行檢測。如Fig 4所示，與對照組相比，當(dāng)不同濃度 IL-1β(1、5、25 μg·L－1)處理24 h后，細(xì)胞內(nèi)GnT-V及β1-6GlcNAc糖支鏈的量被抑制。為了考察β1-6GlcNAc糖支鏈的減少是否會影響其所修飾的β1整合素糖蛋白的量，采用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示(Fig 3)，IL-1β(5 μg·L－1)處理24 h 后，與對照組相比，GnT-V所修飾的β1整合素的量明顯下降。提示IL-1β誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能是通過β1整合素的轉(zhuǎn)錄后修飾完成的。

3 討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cell，VEC)功能障礙是動脈粥樣硬化形成的始動環(huán)節(jié)之一［11］。血管內(nèi)皮不僅是IL-1β和眾多炎癥因子作用的重要靶細(xì)胞，也是一種效應(yīng)細(xì)胞，因此，闡明IL-1β所致的內(nèi)皮細(xì)胞損傷機(jī)制是非常有必要的。本實(shí)驗(yàn)首次證明了IL-1β可以減少GnT-V所修飾的整合素β1糖蛋白的量，從而促進(jìn)凋亡因子的表達(dá)，提高細(xì)胞凋亡率。

近些年研究認(rèn)為炎癥因子，或者氧化應(yīng)激與內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)。課題組證實(shí)H2O2可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡［12］，同時也有文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)TNF-α可以通過ERK通路介導(dǎo)內(nèi)皮祖母細(xì)胞的凋亡［13］。本文通過流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)IL-1β這種炎癥因子也可以誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。因此減少炎癥因子對于內(nèi)皮細(xì)胞的刺激對于動脈粥樣硬化的預(yù)后起著關(guān)鍵的作用。

Fig 4 Effects of IL-1β on GnT-V(A)and β1-integrin protein β1-6GlcNAc modification(B)

近些年的研究發(fā)現(xiàn)β1整合素與細(xì)胞的凋亡密不可分［14］。β1整合素的過表達(dá)可以有效地抑制角膜細(xì)胞的凋亡，從而起到保護(hù)角膜損傷的作用［15］。有文獻(xiàn)報(bào)道［16］，血管生成素-1通過β1整合素介導(dǎo)的Caspase-3降解起到保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。同時也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)IL-1β可以使軟骨細(xì)胞中β1整合素減少，從而加重骨關(guān)節(jié)炎。為此，我們推斷IL-1β是否可以同樣抑制內(nèi)皮細(xì)胞中β1整合素的表達(dá)，從而誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。本文通過Western blot發(fā)現(xiàn)，隨著IL-1β濃度增加，β1整合素的表達(dá)也隨之下降。同時我們也證實(shí)，隨著IL-1β濃度增加，Bcl-2/Bax的比例下降，Caspase-3活性增加。以往的對于β1整合素與凋亡的研究主要集中在其下游信號通路，比如ERK/MAPK信號通路等。β1整合素是一種糖蛋白，研究認(rèn)為N-乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶V(GnT-V)可以調(diào)節(jié)細(xì)胞膜上β1整合素N-glycans的豐度，進(jìn)而調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和黏附等［17］。為此，我們就想了解在內(nèi)皮細(xì)胞中IL-1β能否誘導(dǎo)β1整合素N-位糖基化的變化。在本文中，我們觀察到IL-1β不僅能夠影響N-乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶V及其產(chǎn)物的量，同時可以使整合素β1 N-位糖基化修飾量降低。這些結(jié)果提示我們β1整合素的轉(zhuǎn)錄后修飾可能影響到細(xì)胞的凋亡。IL-1β對功能蛋白N-位糖基化水平及其他信號傳導(dǎo)通路的影響也有待深入研究。

包括內(nèi)皮細(xì)胞在內(nèi)的細(xì)胞凋亡是多因素多步驟的過程，尋找一個合適的治療靶點(diǎn)是目前心血管疾病治療的研究重點(diǎn)。本文對于跨膜蛋白β1整合素轉(zhuǎn)錄后修飾的研究將為日后治療心血管疾病開辟新的靶點(diǎn)。

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