唐洪梅，房財富，廖小紅，李得堂，姚 楠，何嘉侖

(1.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥學部，2.廣州中醫(yī)藥大學，廣東 廣州510405;3.廣東省中醫(yī)研究所 廣東廣州 510095)

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)是一種以腹痛或腹部不適伴排便習慣改變?yōu)樘卣鞯墓δ苄阅c病，腹瀉型腸易激綜合征(D-IBS)患者以腹痛腹瀉為主，同時多伴有頭昏、心煩、失眠、焦慮、抑郁等植物神經(jīng)功能失調(diào)的癥狀，發(fā)病易受精神等因素影響，關于D-IBS的病因和發(fā)病機制目前尚不明確。近年來隨著神經(jīng)胃腸病學和分子生物學研究的發(fā)展，人們認為D-IBS的發(fā)病與慢性心理應激引起的腦腸軸功能紊亂密切相關，D-IBS患者易出現(xiàn)腦腸互動失調(diào)或環(huán)節(jié)障礙［1］。腦腸軸異常可能是導致D-IBS患者對各種應激的運動反應增強和內(nèi)臟敏感性增加的主要因素，是D-IBS病理生理機制的共同通路。腦腸軸的變化和影響在D-IBS的發(fā)病中起重要作用，而腦腸肽作為一類具有神經(jīng)遞質(zhì)和激素雙重功能的小分子多肽，在調(diào)節(jié)內(nèi)臟感覺、分泌和運動中起重要作用。這些神經(jīng)遞質(zhì)主要有五羥色胺(5-hydroxy tryptamine，5-HT)、P物質(zhì)、降鈣素基因相關肽、神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y，NPY)等。這些神經(jīng)遞質(zhì)和D-IBS有著密切的聯(lián)系。本課題組前期的實驗已經(jīng)對P物質(zhì)和降鈣素基因相關肽開展研究，研究結(jié)果表明模型組結(jié)腸黏膜降鈣素基因相關肽和P物質(zhì)的表達分別較正常組及給藥組高［2］。NPY廣泛分布于哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)、周圍神經(jīng)系統(tǒng)以及許多器官中，而且含量豐富。NPY在情感及應激行為發(fā)生的機制中均發(fā)揮重要功能。作為一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，NPY在D-IBS的病理機制中如何發(fā)揮傳遞作用尚未見報道。本文通過免疫組化法檢測D-IBS模型大鼠結(jié)腸組織5-HT的表達，采用熒光定量RT-PCR技術檢測模型大鼠下丘腦和結(jié)腸組織NPY mRNA的表達，同時旨在通過腦腸肽和神經(jīng)遞質(zhì)的研究為D-IBS的腦腸軸異常調(diào)控機制提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物SPF級SD大鼠乳鼠2窩，出生2 d。購自廣東省醫(yī)學實驗中心，實驗動物中心動物合格證號:0088139。

1.2實驗試劑和儀器TRIzol Reagent(美國 Invitrogen公司)，Bio-Rad iQTM5 Multicolor Real-time PCR(美國 Bio-Rad公司)，Bio-Rad SmartSpecTMPlus Spectrophotometer(美國 Bio-Rad公司)，AlphaImager HP凝膠成像系統(tǒng)(美國ProteinSimple公司)，DNase I(美國Fermentas公司)，RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(美國 Fermentas公司)，MaximaTMSYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix(美國 Fermentas公司)。

1.3模型的制備將新生大鼠分為正常組和模型組。出生2 d后的大鼠乳鼠，模型組從乳鼠出生后2～14 d每天與母鼠分隔開180 min，在d 15～27的兩周內(nèi)，模型組將石蠟油潤滑后的輸液導管經(jīng)肛門插入 2 cm，注入 0.087 mol·L－1的醋酸 0.5 ml［3］，每天給予直腸內(nèi)醋酸刺激1次，在醋酸刺激之后，立即用紙袋束縛大鼠的前后肢。限制前上肢搔抓頭面部，但不限制其活動，束縛時間1 h。正常組給予直腸注入0.5 ml生理鹽水。d 29在冰塊上迅速取下大鼠的下丘腦和結(jié)腸組織，用液氮冷凍后置于－80℃冰箱保存。

1.4免疫組化法檢測大鼠下丘腦和結(jié)腸組織5-HT石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2室溫20 min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶。蒸餾水洗滌3次。0.01mol·L－1枸櫞酸鹽緩沖溶液抗原熱修復。PBS洗滌2次。滴加5%BSA封閉液，室溫20 min。甩去多余液體，滴加1∶100稀釋的一抗(羊抗多克隆抗體，大鼠)，4℃過夜。PBS洗2 min×3次。滴加生物素化山羊抗大鼠IgG，37℃ 20 min。PBS洗2 min×3次。滴加試劑SABC，37℃ 30 min。PBS洗5 min×4次。DAB顯色劑室溫顯色，鏡下控制反應時間，蘇木精輕度復染，脫水，透明，封片，400倍顯微鏡觀察。

1.5實時熒光定量RT-PCR檢測NPY mRNA表達

1.5.1總RNA提取和cDNA合成取凍存組織，經(jīng)過液氮研磨后按每100 mg加入1 ml TRIzol試劑，總RNA的提取按TRIzol試劑說明書進行。提取的總RNA用DNaseⅠ處理，以去除DNA污染。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性。用紫外分光光度計檢測總RNA的純度和含量。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒要求，用Oligo(dT)18合成cDNA，在－20℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2引物設計與合成查 NCBI GenBank里的基因序列，用Primer premier 5.0軟件進行引物設計，設計的引物由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。

Tab 1 Primer sequences used for NPY mRNA detection with real time RT-PCR

1.6熒光定量PCR擴增效率檢測進行相對基因表達分析普遍采用 Livak(2－△△Ct)法，條件是目標基因和參照基因擴增效率都接近100% ，且相互間效率偏差在5%以內(nèi)。使用Livak法之前，必須驗證目標基因和參照基因的擴增效率，制備熒光定量PCR標準曲線。稀釋樣品cDNA成5個梯度(105、104、103、102、10)，分別進行靶基因 NPY 及內(nèi)參基因18S的PCR反應，制備兩基因的標準曲線并檢測擴增效率。

1.7實時熒光定量PCR每個樣品均進行 NPY基因和內(nèi)參18S基因的熒光定量 PCR，每個樣品均設兩個平行管。總反應體積 25 μl，反應體系為:12.5 μl SYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix，上下游引物各 1 μl，1 μl cDNA，9.5 μl ddH2O。反應條件:94℃ 5 min;94℃ 30 s，55℃ 40 s，72℃ 50 s，共40個循環(huán);最后 72℃ 7 min結(jié)束反應。PCR擴增結(jié)束后，從55℃至94℃ 每隔10 s上升0.5℃，并收集一次熒光信號獲得熔解曲線，以確定擴增產(chǎn)物的特異性。最終結(jié)果根據(jù)樣品 Ct值，按照 Livak(2－△△Ct)方法計算。

1.8統(tǒng)計學分析結(jié)果用±s表示，用SPSS 15.0統(tǒng)計學軟件對所得數(shù)據(jù)進行t檢驗。

2 結(jié)果

2.1HE染色和免疫組化法在大鼠的下丘腦組織HE染色中，模型組無病理改變(Fig 1)。在大鼠的結(jié)腸組織中，在400倍光鏡下連續(xù)觀察腸腺腔200個細胞，均可見5-HT免疫染色陽性細胞，此類細胞多分布在腸腺腔基底部，以腸腺隱窩部位較多。模型組免疫組化染色陽性細胞體積較大，大多為錐形或圓形，染色強度較強;正常組免疫組化染色陽性細胞體積較小，多為圓形，染色強度較弱(Fig 2)。與正常組比較，模型組5-HT陽性細胞數(shù)增多，免疫組化染色強度增強(均P＜0.01)。

Fig 1 Hypothalamus tissue of model group(A)and control group(B)(HE×200)

Fig 2 Protein distribution of 5-HT in IBS-D rats colon tissue by immunohistochemistry(×400)

2.2實時熒光定量PCR擴增曲線及基因擴增效率從Fig 3中可以計算得出NPY和18S的擴增效率分別為98%和95%。

Fig 3 Quantitative real-time PCR standard curve of NPY(A)and 18S(B)standard templates

2.3PCR產(chǎn)物分析NPY和18S基因PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳證實PCR產(chǎn)物為單一目的條帶。擴增產(chǎn)物大小分別為280 bp及205 bp(Fig 4)。

熔解曲線分析顯示NPY和18S的基因PCR產(chǎn)物的熔解曲線峰值分別為81.5℃及86℃，熔解溫度均一，為單一銳利主峰，說明無引物二聚體及非特異性擴增(Fig 5)。

2.4NPY mRNA在下丘腦和結(jié)腸組織中的相對表達量分析為了校正標本之間RNA的質(zhì)量和反轉(zhuǎn)錄效率的差異，將每一標本檢測所得NPY基因的拷貝數(shù)均和相對應的18S基因的拷貝數(shù)相比來進行標準化。結(jié)果表明，在下丘腦組織中，與正常組相比，模型組NPY基因表達明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，模型組可將NPY mRNA表達下調(diào)約1.66倍(Fig 6);在結(jié)腸組織中，與正常組相比，模型組NPY基因表達明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，模型組可將NPY mRNA表達下調(diào)約1.20倍(Fig 7)。

Fig 4 Agarose gel electrophoresis results

Fig 5 Dissociation curve of NPY and 18S

Fig 6 Relative expression of NPY mRNA in hypothalamus tissues

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學研究認為，IBS的發(fā)病與慢性心理應激引起的腦腸軸功能紊亂密切相關。腦腸軸是將認知和情感中樞與神經(jīng)內(nèi)分泌、腸神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)相聯(lián)系的雙向交通通路，在人的腸肌間神經(jīng)叢內(nèi)存在著神經(jīng)系統(tǒng)，它分泌的神經(jīng)遞質(zhì)同時存在于大腦皮層－神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)。這些神經(jīng)遞質(zhì)不但存在于ENS，也存在于CNS，在調(diào)節(jié)內(nèi)臟感覺、分泌和運動中起重要作用。國外研究學者研究表明，腦內(nèi)許多區(qū)域和核團均參與了胃腸道運動的調(diào)節(jié)，但主要集中在邊緣系統(tǒng)。包括圍繞中腦室周圍的結(jié)構——下丘腦、穹窿、杏仁及扣帶回［4］。IBS患者與健康人群的性格存在較大差異，患者焦慮、抑郁、神經(jīng)質(zhì)和負性生活事件評分明顯高于健康人群。美國一項大規(guī)模社區(qū)人群調(diào)查表明［5］，抑郁狀態(tài)等心理因素易導致IBS患者產(chǎn)生腹痛感覺，并且抑郁的程度與直腸痛覺閾值呈反比關系。

Fig 7 Relative expression of NPY mRNA in colon tissues

NPY廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和腸道交感神經(jīng)叢中。研究認為［6］，NPY通過G蛋白結(jié)合受體(NPY-Rs)與配體結(jié)合而發(fā)揮其作用。腸神經(jīng)叢中的NPY可與腸黏膜下神經(jīng)節(jié)中周圍性膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(pChAT)相結(jié)合而發(fā)揮其效能，或在中樞通過作用于海馬和下丘腦而發(fā)揮其拮抗應激、穩(wěn)定情緒的作用。

本研究表明，與對照組相比，模型組大鼠下丘腦和結(jié)腸組織 NPY mRNA的表達明顯下調(diào)，表明DIBS的腹痛和焦慮情緒與NPY表達下調(diào)有一定的關聯(lián)性。關于腹痛的調(diào)節(jié)機制，NPY及其受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的痛覺調(diào)制中起重要作用，其作用機制或直接通過Y1受體，或間接通過阿片受體。抑制性神經(jīng)遞質(zhì)NPY主要通過Y1受體抑制脊髓背角SP、CGRP和其它致痛性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放起鎮(zhèn)痛作用。關于焦慮情緒的調(diào)節(jié)機制，NPY是人類及哺乳動物體內(nèi)分布最為廣泛及含量最為豐富的肽類物質(zhì)。主要分布于與情感調(diào)節(jié)有關的腦區(qū)(如下丘腦、杏仁核、海馬、藍斑、伏核等)及交感神經(jīng)末梢，參與情感行為的調(diào)節(jié)及應激反應［7］。研究證實這些效應主要是通過 NPY-Y1受體介導的［8］。

5-HT是一種廣泛存在于神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸道的神經(jīng)遞質(zhì)，參與了心理和神經(jīng)功能的調(diào)節(jié)。5-HT的生理作用包括激活腸道分泌功能、對傳入神經(jīng)元的激活及直接對平滑肌的作用，從而參與了胃腸運動、感覺、分泌等過程。研究證實5-HT與D-IBS的病有一定的關系，在D-IBS患者中，患者血漿及結(jié)腸黏膜中的5-HT均明顯升高。Drossman［9］認為 D-IBS患者腸道EC細胞分泌的5-HT通過腦腸軸，參與胃腸道動力和內(nèi)臟感覺的調(diào)控。整個調(diào)節(jié)過程復雜，可能在腦腸軸的不同傳導水平有異常。當外周組織損傷或炎癥時，損傷或者炎癥部位的血小板和肥大細胞都可以釋放5-HT，活化初級傳入感應器，并提高傷害性感應器的敏感性，從而引起傷害性反應和痛覺過敏［10］。生理性刺激(進餐、擴張)及病理性刺激(缺血、應激)促使5-HT釋放，導致內(nèi)臟傳入神經(jīng)及腸神經(jīng)系統(tǒng)高敏感而激活多種神經(jīng)活性物質(zhì)，使參與腦－腸調(diào)節(jié)的化學信號異常。本實驗表明，模型組5-HT明顯升高，5-HT的異常升高會導致腸道動力異常和內(nèi)臟感覺過敏，也是引起腹瀉的重要物質(zhì)，提示5-HT和D-IBS患病關系密切。

由于D-IBS的病理機制還尚且不明確，基于以上實驗結(jié)果，腦腸軸異常機制在D-IBS的發(fā)病機制中起著重要的作用，D-IBS與NPY的表達下調(diào)和5-HT的升高有密切的關系，腦腸軸異常機制的研究為明確D-IBS的機制提供了重要的參考依據(jù)，但DIBS具體調(diào)節(jié)機制還有待進一步研究。

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