孫運(yùn)良 滿曉華 王麗華 吳紅玉 李淑德

1.江蘇省贛榆縣人民醫(yī)院消化內(nèi)科，江蘇 贛榆222100；

2.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院消化內(nèi)科，上海200043

胰腺癌是消化系統(tǒng)惡性程度極高的腫瘤之一，由于其侵襲性強(qiáng)并易發(fā)生早期轉(zhuǎn)移，多數(shù)患者明確診斷時(shí)已屬于晚期，預(yù)后很差。因此，明確其侵襲和轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制，尋找新的診治靶點(diǎn)，是當(dāng)前胰腺癌研究的重要課題。Toll樣受體4 (Toll-like receptor 4，TLR4)是最早發(fā)現(xiàn)的，也是研究最為廣泛的Toll樣受體家族成員。研究已證實(shí)，TLR4在多種腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)，參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［1］。體外研究表明，TLR4在其外源性配體脂多糖(1ipopolysaccharide，LPS)的刺激下，可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，在促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中具有重要的作用［2］。但目前關(guān)于TLR4在胰腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用尚研究較少，其相關(guān)機(jī)制有待于進(jìn)一步明確。本研究通過免疫組化的方法，檢測(cè)胰腺癌組織的TLR4、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase -9，MMP-9)蛋白表達(dá)情況，分析TLR4蛋白表達(dá)與胰腺癌主要臨床病理參數(shù)以及MMP-9蛋白表達(dá)的關(guān)系；以LPS作用于體外培養(yǎng)的人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1，觀察其侵襲力和MMP-9蛋白表達(dá)的變化，初步探討TLR4在胰腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用及其相關(guān)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病例標(biāo)本

收集2007年1月—2010年12月長(zhǎng)海醫(yī)院手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的胰腺導(dǎo)管腺癌石蠟標(biāo)本59例，所有標(biāo)本臨床和病理資料完整。其中男性40例，女性19例；年齡32～76歲，中位年齡62歲；腫瘤位于胰頭38例，胰體尾21例；分化程度為高分化8例，中度分化23例，低分化28例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移37例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例；腫瘤直徑≤3 cm者26例，>3 cm者33例。按照2002年國(guó)際抗癌協(xié)會(huì)(UICC)制定的TNM臨床分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期6例，Ⅱ期19例，Ⅲ期29例，Ⅳ期5例。所有患者手術(shù)前均無(wú)化療、放療或其他針對(duì)腫瘤的治療。另外，隨機(jī)選擇30例癌旁距腫瘤5 cm以上且經(jīng)病理證實(shí)為正常胰腺組織的標(biāo)本作為對(duì)照。

1.1.2 細(xì)胞株

TLR4組成性高表達(dá)的人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。HT-29細(xì)胞在含有10% FBS的RPMI-1640的培養(yǎng)液，PANC-1在含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)液中，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)液中含青霉素、鏈霉素，濃度均為100 U/mL。

1.1.3 主要試劑

兔抗人TLR4多克隆抗體、山羊抗人MMP-9多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司。免疫組化SP試劑盒、 DAB顯色劑均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和Real-time PCR試劑盒均為TaKaRa公司產(chǎn)品。Transwell小室購(gòu)自Coster公司，Matrigel購(gòu)自BD公司。 LPS為Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化染色

采用免疫組織化染色超敏兩步法(SP染色法)檢測(cè)正常胰腺組織和胰腺癌組織中TLR4、MMP-9蛋白表達(dá)，具體操作步驟按SP免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行。用已知TLR4、MMP-9蛋白表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性的結(jié)腸癌組織切片作為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS替代一抗作為陰性對(duì)照。TLR4、MMP-9蛋白陽(yáng)性染色為細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒，隨機(jī)觀察5個(gè)不同高倍視野(×400)，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞率分別記分進(jìn)行半定量結(jié)果判斷［3］。陽(yáng)性細(xì)胞率≤5%為0分，6%～29%為1分，30%～49%為2分，≥50%為3分；細(xì)胞無(wú)著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。根據(jù)兩項(xiàng)積分將TLR4、MMP-9蛋白表達(dá)分為：0分和1分為陰性(-)，2分為弱陽(yáng)性(+)，3分和4分為中等強(qiáng)度陽(yáng)性(+ +)，5分及以上者為強(qiáng)陽(yáng)性(+ + +)。陽(yáng)性表達(dá)率以表達(dá)陽(yáng)性(包括弱陽(yáng)性、中等陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性之和)的病例占總病例數(shù)的百分比表示。

1.2.2 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)TLR4、MMP-9蛋白表達(dá)

收集正常培養(yǎng)的HT-29、PANC-1細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，取20 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移2 h后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入兔抗人TLR4多克隆抗體，4 ℃溫育過夜，洗膜，加入辣根過氧化物酶(HRP)羊抗兔二抗，室溫輕搖2 h，洗膜，加入增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)液，暗室顯影、定影。以1 μg/mL的LPS分別作用于PANC-1細(xì)胞0、3、6、12和24 h，收集各組細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行MMP-9蛋白表達(dá)的檢測(cè)。結(jié)果用凝膠圖像軟件分析系統(tǒng)對(duì)膠片掃描，與內(nèi)參照β-actin進(jìn)行比較，計(jì)算其比值。

1.2.3 Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲力

以1 μg/mL的LPS作用于PANC-1細(xì)胞24 h，同時(shí)以正常培養(yǎng)的PANC-1細(xì)胞作為對(duì)照。收集兩組培養(yǎng)的細(xì)胞，用無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)液制備成5×105/mL細(xì)胞懸液。用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液將Matrigel稀釋，每個(gè)Transwell小室加入50 μL。待Matrigel充分聚合后，Transwell小室加入600 μL含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液。取200 μL細(xì)胞懸液，接種至Transwell上室，常規(guī)培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室，用棉簽拭去聚碳酸酯膜表面的Matrigel，PBS輕輕沖洗，晾干，然后用0.1%結(jié)晶紫染色10 min，去除多余結(jié)晶紫染液，普通光學(xué)顯微鏡下觀察。每個(gè)樣本隨機(jī)選取4個(gè)200倍視野，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)并計(jì)算平均值，以穿膜細(xì)胞的數(shù)目表示腫瘤細(xì)胞的侵襲力。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，計(jì)量資料以表示。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)與方差分析；相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 TLR4、MMP-9蛋白在癌旁正常胰腺組織和胰腺癌組織中的表達(dá)

TLR4蛋白陽(yáng)性染色位于細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)，以細(xì)胞膜為主(圖1A、1B)。癌旁正常胰腺組織TLR4蛋白表達(dá)陰性(-)25例、弱陽(yáng)性(+)4例，陽(yáng)性(++)1例，陽(yáng)性表達(dá)率為16.7%；胰腺癌組織中TLR4蛋白表達(dá)陰性(-)16例、弱陽(yáng)性(+)9例、中等強(qiáng)度陽(yáng)性(++)22例、強(qiáng)陽(yáng)性(+++)12例，陽(yáng)性表達(dá)率為72.9%，兩者陽(yáng)性表達(dá)率相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

MMP-9蛋白陽(yáng)性染色位于細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)，以細(xì)胞質(zhì)為主(圖1C、1D)。癌旁正常胰腺組織MMP-9蛋白表達(dá)陰性(-)26例、弱陽(yáng)性(+)4例，陽(yáng)性表達(dá)率為13.3%；胰腺癌組織中MMP-9蛋白表達(dá)陰性(-)18例、弱陽(yáng)性(+)9例、中等強(qiáng)度陽(yáng)性(++)20例、強(qiáng)陽(yáng)性(+++)12例，陽(yáng)性表達(dá)率為69.5%，兩者陽(yáng)性表達(dá)率相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2 TLR4、MMP-9蛋白表達(dá)與胰腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

TLR4蛋白表達(dá)與胰腺癌患者的年齡、性別、腫瘤的部位、直徑及分化程度無(wú)關(guān)。伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胰腺癌組織中TLR4蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為83.8%，顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的54.5%(P<0.05)；TNM分期為Ⅲ+Ⅳ期的胰腺癌組織中TLR4蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為85.3%，與Ⅰ+Ⅱ期的56.0%相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。MMP-9蛋白表達(dá)與胰腺癌患者的年齡、性別、腫瘤的部位、直徑無(wú)關(guān)，而與腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期密切相關(guān)(P<0.05，表1)。

表 1 TLR4、MMP-9蛋白表達(dá)與胰腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab.1 Relationship between TLR4, MMP-9 protein expressions and clinicopathologic parameters of pancreatic ductal adenocarcinoma

2.3 胰腺癌組織中TLR4、MMP-9蛋白表達(dá)的相關(guān)性

Spearman等級(jí)相關(guān)分析表明，胰腺癌組織中TLR4蛋白表達(dá)與MMP-9蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.384，P=0.003；圖2)。

2.4 PANC-1細(xì)胞TLR4蛋白表達(dá)情況

與HT-29細(xì)胞相比，PANC-1細(xì)胞TLR4蛋白呈高表達(dá)(圖3)。

2.5 LPS對(duì)PANC-1細(xì)胞侵襲力的影響

侵襲實(shí)驗(yàn)表明，LPS組的侵襲細(xì)胞數(shù)目為96.7±9.7，顯著高于正常組的54.7±6.3(P<0.01，圖4)。

2.6 LPS對(duì)PANC-1細(xì)胞MMP-9蛋白表達(dá)的影響

經(jīng)LPS作用6、12、24 h后，PANC-1細(xì)胞MMP-9蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.65±0.09、0.67±0.10和0.55±0.09，均顯著高于正常組的0.32±0.05(P<0.01，圖5)。

3 討 論

Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)是學(xué)者們?cè)谘芯抗壟咛グl(fā)育過程中發(fā)現(xiàn)的dToll 基因所編碼的一種穿膜受體蛋白， 隨后在人類細(xì)胞表面鑒定出與其同源的Toll樣蛋白，并命名為TLR，即TLR4。TLR4主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面，在機(jī)體的天然免疫過程中發(fā)揮重要的作用［4］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，TLR4除了在免疫細(xì)胞表達(dá)外，還在腫瘤細(xì)胞呈高表達(dá)，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［5-7］。Sheyhidin等［8］通過RT-PCR和免疫組化的方法檢測(cè)了87例食管鱗癌組織及相應(yīng)癌旁組織中TLR4的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，TLR4在食管鱗癌組織中呈高表達(dá)，且與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及浸潤(rùn)深度有關(guān)。Wang等［9］的研究結(jié)果表明，TLR4在結(jié)腸癌組織中呈高表達(dá)，且與肝轉(zhuǎn)移及腫瘤的TNM分期密切相關(guān)。本研究也發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌組織中，TLR4蛋白表達(dá)顯著高于正常胰腺組織，且與胰腺癌的TNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；TLR4蛋白在胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1中呈高表達(dá)，經(jīng)LPS刺激后，PANC-1細(xì)胞的侵襲力顯著增加。提示TLR4與胰腺癌的發(fā)生有關(guān)，且在促進(jìn)胰腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移中起著重要的作用。

關(guān)于TLR4促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，目前尚未完全闡明。研究表明，腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個(gè)多階段、多因素參與的復(fù)雜過程，細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的降解是其中的關(guān)鍵步驟。MMP-9可降解、破壞靠近腫瘤表面的細(xì)胞外基質(zhì)，使腫瘤細(xì)胞沿著缺失的基底膜向周圍組織浸潤(rùn)，最終導(dǎo)致腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。大量的研究已證實(shí)，MMP-9在包括胰腺癌在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起到了重要的作用［10-12］。本研究結(jié)果也顯示，在胰腺癌組織中，MMP-9蛋白呈高表達(dá)，且與胰腺癌的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期密切相關(guān)。經(jīng)LPS刺激后，PANC-1細(xì)胞在侵襲力增加的同時(shí)，MMP-9蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，表明MMP-9是TLR4促進(jìn)胰腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移中重要的下游蛋白。Xu等［6］通過對(duì)肺癌的研究也發(fā)現(xiàn)，TLR4的激活，可誘導(dǎo)MMP-9表達(dá)，從而促進(jìn)肺癌細(xì)胞的侵襲。

總之，本研究結(jié)果表明，TLR4蛋白的高表達(dá)在胰腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移中起著重要的作用，其機(jī)制可能與促進(jìn)MMP-9蛋白表達(dá)有關(guān)。但胰腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移涉及多方面的復(fù)雜因素，TLR4蛋白的異常表達(dá)可能只是其中的一種形式，其確切的分子機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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