張家麗 任秀寶

天津市腫瘤防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市腫瘤研究所免疫實(shí)驗(yàn)室，

天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院生物治療科，天津 300060

小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer)又稱小細(xì)胞未分化癌，是一種特殊類型的肺癌，約占全部肺癌的15%～20%［1］；具有惡性度高、進(jìn)展快，傾向全身播散，預(yù)后差等特點(diǎn)。研究小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移機(jī)制，尋求新的治療方案，延長(zhǎng)小細(xì)胞肺癌患者的生存期成為目前的研究熱點(diǎn)。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一種多功能的細(xì)胞因子，對(duì)腫瘤血管的生成有較強(qiáng)誘導(dǎo)作用，在大多數(shù)腫瘤組織中高表達(dá)。有研究表明，VEGF對(duì)CD34+造血干細(xì)胞向樹突狀細(xì)胞(dentric cell，DC)的分化具有較強(qiáng)的抑制作用，不但可以抑制DC的成熟，還可以阻礙DC的抗原遞呈功能，抑制DC等抗原遞呈細(xì)胞的分化，進(jìn)一步影響細(xì)胞毒性T細(xì)胞的擴(kuò)增、活化及免疫殺傷作用，未成熟的DC可以誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)的生成，負(fù)向調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫監(jiān)視功能，導(dǎo)致腫瘤的免疫逃逸［2-3］。本研究旨在探討小細(xì)胞肺癌中VEGF的表達(dá)及其與DC成熟的關(guān)系，并分析其與臨床資料的相關(guān)性，為小細(xì)胞肺癌的治療提供參考。

1 資料和方法

1.1 標(biāo)本

收集天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院自2000年1月—2010年9月手術(shù)切除的13例小細(xì)胞肺癌患者術(shù)后癌組織標(biāo)本及癌旁正常組織(癌組織邊緣外>2 cm的組織)標(biāo)本，以及61例小細(xì)胞肺癌患者術(shù)后癌組織標(biāo)本。所有患者術(shù)前未行任何抗癌治療，均有完整的臨床病歷資料。術(shù)后立即取材經(jīng)4%甲醛液固定，常規(guī)石蠟包埋；術(shù)后病理診斷為小細(xì)胞肺癌。61例小細(xì)胞肺癌患者中男性47例，女性14例，男女比例為3.4∶1；中位年齡58歲。

1.2 主要試劑

一抗小鼠抗人CD1a單克隆抗體購(gòu)于santa cruz公司，一抗兔抗人CD83多克隆抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，一抗小鼠抗人Foxp3單克隆抗體購(gòu)自美國(guó) eBioscience 公司，一抗兔抗人VEGF單克隆抗體、工作液及DAB均購(gòu)于中杉金橋公司，二抗購(gòu)自福州邁新公司。

1.3 免疫組化檢測(cè)VEGF、CD1a、CD83、Foxp3的表達(dá)

將小細(xì)胞肺癌組織、癌旁正常組織的蠟塊按4 mm厚度切片，常規(guī)脫蠟水化。在pH為6.0的0.01 mmol/L枸櫞酸鹽緩沖液中高壓抗原修復(fù)，加一抗稀釋液(CD1a、CD83抗體稀釋度為1∶600；Foxp3抗體稀釋度為1∶200)，4 ℃濕盒溫育過夜，加入二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。以PBS代替一抗做空白對(duì)照。

1.4 免疫組化結(jié)果的判定

VEGF定位于細(xì)胞質(zhì)，將細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)均勻一致的棕黃色顆粒定義為陽(yáng)性細(xì)胞。CD1a、CD83定位于細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)，將細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)均勻一致的棕黃色顆粒定義為陽(yáng)性細(xì)胞。Foxp3定位于細(xì)胞核，將細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒定義為陽(yáng)性細(xì)胞。VEGF的表達(dá)結(jié)果判斷參照文獻(xiàn)［4］：①陽(yáng)性細(xì)胞評(píng)分：0分為無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞，1分為陽(yáng)性細(xì)胞<25%，2分為陽(yáng)性細(xì)胞26%～50%，3分為陽(yáng)性細(xì)胞>50%；②染色強(qiáng)度評(píng)分：0分為陰性，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。陽(yáng)性細(xì)胞百分率染色強(qiáng)度為總積分，0～2分為陰性，3～4分為弱陽(yáng)性，5～6分為強(qiáng)陽(yáng)性。CD1a、CD83的結(jié)果判定根據(jù)Furukawa等［5］提出的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野(×400)，觀察計(jì)數(shù)DC，計(jì)算每個(gè)高倍視野的DC平均數(shù)。根據(jù)每個(gè)高倍視野中DC的數(shù)目進(jìn)行分組：將沒有DC表達(dá)定為陰性組，有DC表達(dá)定為陽(yáng)性組。Foxp3結(jié)果判定，選擇著色最深的10個(gè)代表區(qū)在高倍鏡(×40)下每區(qū)隨機(jī)計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，共計(jì)1 000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞陽(yáng)性比例的平均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量資料采用表示，多組間比較采用單因素方差分析，癌與癌旁正常組織比較應(yīng)用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，與臨床資料之間的分析采用χ2檢驗(yàn)，通過計(jì)算Pearson系數(shù)來(lái)分析小細(xì)胞肺癌組織中不成熟DC表達(dá)與Foxp3陽(yáng)性細(xì)胞比例的相關(guān)性。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 VEGF、CD1a、CD83、Foxp3在癌組織與癌旁正常組織的表達(dá)

VEGF主要是在小細(xì)胞肺癌腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，并且在腫瘤壞死組織邊緣及腫瘤浸潤(rùn)區(qū)表達(dá)較強(qiáng)，在血管內(nèi)皮細(xì)胞也可有陽(yáng)性表達(dá)(圖1A)，13例小細(xì)胞肺癌患者癌組織中的VEGF表達(dá)明顯高于癌旁正常組織(P=0.000)。

以CD1a、CD83為標(biāo)志的DC呈棕褐色樹突狀散在分布于腫瘤組織中(圖1B、C)，13例小細(xì)胞肺癌患者中每高倍視野癌組織中CD1a+DC數(shù)量顯著高于癌旁正常組織(5.49±3.55vs1.94±0.86，P=0.007)，每高倍視野癌組織中CD83+DC數(shù)量顯著低于癌旁正常組織(0.72±0.77vs3.15±2.32，P=0.002) 。

Foxp3為細(xì)胞核表達(dá)呈棕黃色(圖1D)，13例小細(xì)胞肺癌患者每高倍視野癌組織中Foxp3+淋巴細(xì)胞比例顯著高于癌旁正常組織(5.88%±4.21%vs0.031%±0.075 %，P=0.005)。

2.2 VEGF、CD1a、CD83、Foxp3在癌組織中的表達(dá)

在61例小細(xì)胞肺癌癌組織中，VEGF表達(dá)陽(yáng)性50例，陽(yáng)性率81.97%；有51例檢測(cè)到CD1a+DC，陽(yáng)性率為83.61%；有36例檢測(cè)到CD83+DC，陽(yáng)性率為59.02%；有52例檢測(cè)到Foxp3+淋巴細(xì)胞，陽(yáng)性率為85.25%。

2.3 VEGF與CD1a、CD83、Foxp3之間表達(dá)的相關(guān)性

CD1a+DC數(shù)量在VEGF陰性、陽(yáng)性組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05) ，CD83+DC數(shù)量在VEGF陰性、陽(yáng)性組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

2.4 CD1a、CD83與Foxp3之間表達(dá)的相關(guān)性

在檢測(cè)到CD1a+DC的51例標(biāo)本中，F(xiàn)oxp3的陽(yáng)性率為86.27%，每高倍視野Foxp3+淋巴細(xì)胞比例顯著高于CD1a陰性組(6.34%±4.36%vs4.36%±2.29%，P<0.05)。CD1a+DC數(shù)量與Foxp3+T細(xì)胞陽(yáng)性比例之間呈正相關(guān)(r=0.373，P=0.007，圖2)。

表 1 61例腫瘤浸潤(rùn)DC、Foxp3+Treg與VEGF表達(dá)關(guān)系Tab.1 The relationship of DC, Foxp3+Treg and the expression of VEGF in 61 case

Foxp3在CD83+DC表達(dá)的陽(yáng)性率為80.56%，在CD83陽(yáng)性組中Foxp3+淋巴細(xì)胞每高倍視野陽(yáng)性比例與CD83陰性組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(5.42%±3.73%vs6.55%±4.82%，P>0.05)。CD83陽(yáng)性DC數(shù)量與Foxp3+T細(xì)胞陽(yáng)性比例之間無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。

2.5 CD1a、CD83、Foxp3表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

通過上述指標(biāo)與患者各臨床病理特征進(jìn)行相關(guān)性分析后發(fā)現(xiàn)，CD1a、Foxp3在患者不同年齡、吸煙史、腫瘤家族史、胸膜粘連、腫塊大小、腫瘤類型、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，僅CD83+DC在小細(xì)胞肺癌患者不同腫塊大小之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.665，P=0.030)。

3 討 論

小細(xì)胞肺癌較其他類型肺癌診斷前的癥狀期短，確診后5年生存率僅為2%～10%，而10年生存率僅為1%～2%［6-7］，約2/3的患者就診時(shí)已有全身廣泛轉(zhuǎn)移。小細(xì)胞肺癌的腫瘤倍增時(shí)間僅33 d，且絕大多數(shù)為低分化癌。

人體免疫系統(tǒng)具有免疫監(jiān)視功能，能識(shí)別和殺傷“非己”物質(zhì)，使機(jī)體可以通過天然和獲得性免疫抵抗腫瘤。然而腫瘤在這種免疫監(jiān)視下仍能發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移，表明腫瘤具有逃避機(jī)體免疫監(jiān)視的功能。研究表明，在腫瘤微環(huán)境內(nèi)參與腫瘤組織與自身免疫系統(tǒng)相互作用的因素主要包括：局部抗原遞呈細(xì)胞功能障礙、抑制性免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞作用及免疫負(fù)調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子作用等。DC作為機(jī)體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原呈遞細(xì)胞，在抗腫瘤免疫中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在本實(shí)驗(yàn)所檢測(cè)到的VEGF陽(yáng)性表達(dá)的小細(xì)胞肺癌組織中，CD83的表達(dá)顯著低于VEGF陰性表達(dá)的組織，且VEGF表達(dá)陽(yáng)性與強(qiáng)陽(yáng)性組織中，CD83的表達(dá)也存在差異，提示VEGF影響DC的成熟。這與Strauss等［8］在頭頸部腫瘤的研究以及Mahnke等［9］研究報(bào)道的結(jié)論相一致，并且得到了體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)的證實(shí)［10-11］。

Treg主要在機(jī)體免疫系統(tǒng)中發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)作用，可以抑制識(shí)別自身腫瘤細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞的發(fā)育和活化，在介導(dǎo)機(jī)體腫瘤免疫耐受中起重要作用。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)oxp3標(biāo)志的Treg細(xì)胞在癌組織中的表達(dá)高于癌旁正常組織，與Viguier等［12］的結(jié)論一致。

VEGF在腫瘤免疫微環(huán)境中的作用除了對(duì)DC的成熟有影響外，也在Treg的生成中發(fā)揮一定作用［13］。研究顯示，VEGF的過度表達(dá)會(huì)導(dǎo)致Treg數(shù)量的增多，而抑制VEGF與其受體VEGFR結(jié)合可導(dǎo)致Treg數(shù)量減少，從而導(dǎo)致抗腫瘤活性增強(qiáng)；但其機(jī)制尚未明確，可能與VEGF抑制DC的成熟有關(guān)［14］。本實(shí)驗(yàn)中Foxp3表達(dá)在CD1a陽(yáng)性組與陰性組存在差異，且與CD1a陽(yáng)性表達(dá)呈正相關(guān)，提示Foxp3+T細(xì)胞與不成熟DC有關(guān)，與Mahnke等［15］在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的結(jié)論相一致。而這一結(jié)論也在非小細(xì)胞肺癌研究中得到證實(shí)，未成熟DC可通過誘導(dǎo)Treg細(xì)胞生成，而導(dǎo)致腫瘤的免疫逃逸。目前認(rèn)為，DC影響Treg細(xì)胞介導(dǎo)免疫逃逸的機(jī)制主要是不成熟DC分泌TGF-b和(或)IL-10誘導(dǎo)初始T細(xì)胞向Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)化，增加Treg細(xì)胞的水平［16-17］。

總之，本研究結(jié)果證實(shí)，在小細(xì)胞肺癌中，VEGF可以影響DC的成熟，進(jìn)而影響Treg細(xì)胞的表達(dá)，從而導(dǎo)致了腫瘤的免疫逃逸，這為腫瘤的免疫治療奠定了基礎(chǔ)。

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