李國惠 劉天德 余新 劉秀霞 袁榮發(fā) 蔣成行 邵江華,

1.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝膽外科，江西 南昌330006；

2.江西省分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330006；

3.金華市中心醫(yī)院肝膽外科，浙江 金華 321000

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是常見的惡性腫瘤之一，居全球腫瘤發(fā)病率的第五位，主要高發(fā)于東南亞、撒哈拉以南的地區(qū)和歐洲南部，其發(fā)病率和死亡率均呈逐年上升的趨勢［1］。在我國，年發(fā)病率高達(dá)35～50/10萬，增長速度非常快，已升至消化道腫瘤的第二位，嚴(yán)重威脅著人民的生命健康。盡管近年來HCC診斷、治療技術(shù)不斷進(jìn)步，但預(yù)后仍然較差。如何阻斷慢性肝臟疾病向HCC的惡性轉(zhuǎn)化，并在疾病尚處于早期階段及時(shí)采取有效措施進(jìn)行防治已成為能否進(jìn)一步提高HCC療效的關(guān)鍵。HCC的發(fā)生是一個(gè)多基因參與的多階段、多步驟過程，涉及肝細(xì)胞損傷修復(fù)、腫瘤基因和抑癌基因作用的復(fù)雜過程。

Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶(Rho associated coiled coil forming protein kinase ,Rock)是Rho/Rock信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵信號(hào)分子，包括Rock1和Rock2兩種亞單位，兩者有65%完全一致，90%的激酶區(qū)域存在同一性［2］。Rock1和Rock2是分子量約1.6×105的絲、蘇氨酸激酶，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種行為和功能，并與腫瘤惡性程度、腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、細(xì)胞的黏附、收縮、遷移和胞漿的分裂有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，在許多不同的腫瘤組織中均觀察到Rock2基因表達(dá)的增高［3］。本研究通過紫外線(ultraviolet，UV)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞DNA損傷，觀察Rock2對(duì)肝癌細(xì)胞的保護(hù)作用，為提高HCC預(yù)后提供新的治療靶向基因。

1 材料和方法

1.1 材料

主要試劑：DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)，胎牛血清(Hyclone公司)，總RNA抽提試劑TRIzol和脂質(zhì)體LipfectamineTM2000(Invitrogen公司)，一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)，SYBR Green熒光定量PCR Mix(Qiagen公司)，shRock2(Santa Cruz公司)，羊抗多克隆Rock2一抗(Santa Cruz，sc-1851)，兔抗多克隆Cdc25A一抗(Santa Cruz，sc-97)。Cdk2/Cyclin E活性熒光共振能量轉(zhuǎn)移法定量檢測試劑盒購自美國GENMED公司。Rock2引物：Sense：5’-ATTCAGCAGCTGGAATCTAA-3’和Antisense：5’-GTCTCTTCTCCAGTTCTAC-3’，長度為238 bp，購自上海生工生物工程有限公司。人肝細(xì)胞性肝癌細(xì)胞株Huh-7和HepG2由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 細(xì)胞株的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

將Huh-7和HepG2細(xì)胞株接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的環(huán)境中培養(yǎng)。按脂質(zhì)體LipfectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分不同時(shí)段檢測細(xì)胞生長情況。

1.3 shRNA轉(zhuǎn)染后實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)Rock2 mRNA的檢測

轉(zhuǎn)染shRock2的肝癌細(xì)胞48 h后，抽提總RNA經(jīng)純度分析后，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。測定cDNA濃度，稀釋為統(tǒng)一的200 ng/μL。同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組、干擾無意義組及轉(zhuǎn)染PBS組。采用SYBR Green法，在ABI PRISM 7500自動(dòng)熒光PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)條件：95 ℃ 15 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算目的基因Rock2和GAPDH的mRNA量，每個(gè)樣品Rock2與GAPDH基因濃度比值，即為校正后的相對(duì)含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 shRock2轉(zhuǎn)染后對(duì)Rock2蛋白的檢測

干擾Rock2表達(dá)48 h后，提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，取等量50 μg 蛋白質(zhì)樣品加入上樣緩沖液煮沸5 min 后行10% SDS-PAGE電泳、濕轉(zhuǎn)，然后分別結(jié)合對(duì)應(yīng)一抗及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，應(yīng)用ECL 發(fā)光試劑顯示蛋白質(zhì)條帶，暗室曝光。每組實(shí)驗(yàn)共平行進(jìn)行3次。

1.5 UV誘導(dǎo)DNA損傷

洗凈培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，利用Stratalinker 2400紫外交聯(lián)儀，254 nm波長進(jìn)行細(xì)胞照射，劑量為100 J/m2。培養(yǎng)2 h進(jìn)行檢測或繼續(xù)培養(yǎng)。

1.6 MTT比色法檢測各組細(xì)胞的增殖

1.7 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測Cdc25A的表達(dá)

細(xì)胞接種6孔板，干擾Rock2 48 h后，行UV照射100 J/m2，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。提取總蛋白，進(jìn)行Western blot檢測。

1.8 Cdk2/Cyclin E活性的檢測

將Huh-7和HepG2細(xì)胞按每孔8×103接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加液量200 μL，干擾Rock2 48 h后，行UV照射100 J/m2，Cdk2/Cyclin E活性檢測按照熒光共振能量轉(zhuǎn)移法定量檢測試劑盒說明書進(jìn)行。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 shRock2轉(zhuǎn)染后Rock2 mRNA的表達(dá)情況

將shRock2轉(zhuǎn)染到肝癌細(xì)胞Huh-7和HepG2中，沉默Rock2表達(dá)48 h后，熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，Rock2 mRNA的表達(dá)較對(duì)照組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而正常組、干擾無意義組及PBS組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖1)。

2.2 shRock2轉(zhuǎn)染后Rock2 蛋白的表達(dá)情況

將shRock2轉(zhuǎn)染到肝癌細(xì)胞Huh-7和HepG2中，沉默Rock2表達(dá)48 h后，Western blot檢測結(jié)果顯示，Rock2 蛋白的表達(dá)較對(duì)照組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而正常組、干擾無意義組及PBS組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖2)。

2.3 UV誘導(dǎo)DNA損傷時(shí)肝癌細(xì)胞增殖的變化

利用UV照射肝癌細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞增殖受到抑制，而且Rock2低表達(dá)組肝癌細(xì)胞的增殖抑制更為明顯。這表明UV造成DNA損傷時(shí)，Rock2對(duì)肝癌細(xì)胞的生存起保護(hù)作用(圖3)。

2.4 UV誘導(dǎo)DNA損傷時(shí)對(duì)Rock2及Cdc25A表達(dá)情況的影響

沉默Rock2基因48 h后，利用UV 100 J/m2照射細(xì)胞，然后繼續(xù)培養(yǎng)2 h，提取總蛋白Western blot檢測Cdc25A表達(dá)情況。結(jié)果顯示，DNA損傷時(shí)抑制Rock2表達(dá)可導(dǎo)致肝癌細(xì)胞中Cdc25A表達(dá)進(jìn)一步下降(圖4)。

2.5 Cdk2/Cyclin E活性與Cdc25A表達(dá)的關(guān)系

Cdk2/Cyclin E是Cdc25A調(diào)控DNA復(fù)制起始最重要的調(diào)控因子，結(jié)果顯示，UV誘導(dǎo)DNA損傷后，Cdk2/Cyclin E活性隨Cdc25A表達(dá)的降低而下降(圖5)。

3 討 論

Rock是新近發(fā)現(xiàn)的Rho/Rock信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵信號(hào)分子，研究報(bào)道的Rho /Rock通路可以作為腫瘤治療的靶點(diǎn)［4］。DNA損傷可引發(fā)多種細(xì)胞反應(yīng)，包括DNA修復(fù)、細(xì)胞周期延遲或阻滯及細(xì)胞凋亡等，其中細(xì)胞周期延遲或阻滯是通過DNA損傷檢查點(diǎn)完成的。如果DNA損傷不能得到及時(shí)糾正，則會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的后果，如癌變等［5-6］。Cdc25A是控制G1/S期調(diào)節(jié)途徑的重要檢查點(diǎn)蛋白，在轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)激活作用中是一個(gè)重要的效應(yīng)分子［7］。

本課題組成功對(duì)Rock2實(shí)施了基因沉默，證實(shí)將shRNA轉(zhuǎn)染入肝癌細(xì)胞Huh-7和HepG2后，誘導(dǎo)RNA干擾效應(yīng)，可有效抑制Rock2在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。當(dāng)UV誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞DNA損傷時(shí)，干擾Rock2組較Rock2正常組肝癌細(xì)胞的增殖抑制更加顯著，表明Rock2對(duì)肝癌細(xì)胞的生存起保護(hù)作用。正常情況下，UV引起細(xì)胞DNA損傷時(shí)，Cdc25A表達(dá)降低，其下游作用檢查點(diǎn)Cdk2/Cyclin E活性也隨之下降。然而在UV引起細(xì)胞DNA損傷的情況下，抑制Rock2表達(dá)時(shí)，發(fā)現(xiàn)Cdc25A表達(dá)降低更為明顯，而且Cdk2/Cyclin E活性也隨之下降。

在人細(xì)胞中，Cdc25A過表達(dá)會(huì)引起Cdk2/Cyclin E依賴激酶的早期激活，導(dǎo)致細(xì)胞過早進(jìn)入S期，細(xì)胞生長的失控，極可能引起惡性轉(zhuǎn)化［8］。相反，Cdc25A表達(dá)的降低可以導(dǎo)致Cdk2/Cyclin E活性的降低和Cdc45直接作用DNA復(fù)制起始的抑制［9］。當(dāng)細(xì)胞中不能降低Cdc25A表達(dá)時(shí)會(huì)表現(xiàn)出檢查點(diǎn)阻滯功能的障礙，包括抗輻射的DNA合成及Cdk2活性的升高。表明Rock2可能是通過調(diào)節(jié)Cdc25A的表達(dá)及Cdk2/Cyclin E活性而對(duì)肝癌細(xì)胞的生存起保護(hù)作用。

目前，本課題組正在深入尋找肝癌細(xì)胞中Rock2如何作用于Cdc25A的調(diào)節(jié)機(jī)制及上游的作用激酶。通過進(jìn)一步研究，將闡述Rock2在HCC形成過程中的蛋白作用通路，Rock2有望成為HCC的診斷、治療以及術(shù)后檢測的靶基因。

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