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四川大學(xué)華西醫(yī)院生物治療國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及分子靶向治療研究室，△腹部腫瘤科，四川 成都 610041

肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是影響預(yù)后的主要因素［1］，因此研究與肝癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的相關(guān)分子機(jī)制是該領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)。Aes(amino-terminal enhancer of split，Aes)是轉(zhuǎn)錄因子Groucho/TLE家族成員，能與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合調(diào)控轉(zhuǎn)錄，但不具有DNA結(jié)合位點(diǎn)［2］。近期的研究表明Aes能夠通過抑制notch信號(hào)通路抑制結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移，且Aes的表達(dá)缺失能夠促進(jìn)結(jié)腸癌的血行轉(zhuǎn)移［3-4］，提示Aes在腫瘤轉(zhuǎn)移中扮演著重要角色。為進(jìn)一步探討Aes在肝癌轉(zhuǎn)移中的作用，我們檢測(cè)了Aes在不同肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況，通過構(gòu)建Aes表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染其低表達(dá)的肝癌細(xì)胞系HepG2，觀察其對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系

人肝癌細(xì)胞系HepG2、SMMC-7721為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑

細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI-1640、小牛血清，轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000、Opti-MEM均購自美國Invitrogen公司，兔抗人Aes多克隆抗體購自美國Sigma公司，鼠抗人β-actin單克隆抗體購自武漢博士德公司，CCK-8試劑盒購自日本Dojindo公司，RT-PCR試劑盒購自TaKaRa，質(zhì)粒pEGFP-N1為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒的構(gòu)建和細(xì)胞轉(zhuǎn)染及實(shí)驗(yàn)分組

通過Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)Aes(NM_001130)的引物，上游引物HindⅢ5’-CCCAAGCTTCCGCGATTGACATGAT-3’、下游引物KpnⅠ 5’-GGGGTACCGTATCCGACTTC TCGCCAT-3’，以cDNA為模板擴(kuò)增Aes片段，雙酶切目的片段，將其連到pEGFP-N1的HindⅢ和KpnⅠ位點(diǎn)，通過酶切鑒定以及測(cè)序驗(yàn)證。依照說明書，通過LipofectamineTM2000分別將pEGFP-N1和pEGFP-Aes轉(zhuǎn)入肝癌細(xì)胞系HepG2，實(shí)驗(yàn)分pEGFP-N1(對(duì)照組)和pEGFPAes(實(shí)驗(yàn)組)。

1.2.2 RT-PCR檢查Aes mRNA的表達(dá)

設(shè)計(jì)A e s上下游引物，上游引物：5’-CACCAGGAGGATGATGGCGAG-3’，下游引物：5’-GGCGTGGAGGTGTCTGGAACTA-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物為560 bp。以GADPH為內(nèi)參，其上游引物序列為5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTT G-3’，下游引物序列為5’-AGGGGCCAT CCACAGTCTTC-3’。TRIzol試劑提取待測(cè)細(xì)胞的總RNA，取一定量的RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后，進(jìn)行半定量PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)不同細(xì)胞系中Aes的表達(dá)及外源Aes的表達(dá)

收集對(duì)數(shù)期生長的待測(cè)細(xì)胞及轉(zhuǎn)染48 h之后的細(xì)胞，RIPA裂解液重懸細(xì)胞并反復(fù)吹打，超聲破碎后，4 ℃，134 00×g，離心15 min。取上清液作為細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取一定量的蛋白樣品40 μg，進(jìn)行12%SDSPAGE；260 mA濕轉(zhuǎn)90 min至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗4 ℃溫育過夜，TBST洗滌3次，加入二抗避光溫育，搖床2 h，Odyssey紅外激發(fā)掃描成像系統(tǒng)掃描成像結(jié)果。

1.2.4 熒光顯微鏡觀察蛋白定位

轉(zhuǎn)染pEGFP-N1和pEGFP-Aes的細(xì)胞在Nikon熒光顯微鏡藍(lán)光激發(fā)下，綠色熒光蛋白發(fā)綠光。

1.2.5 細(xì)胞增殖能力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞以每孔1×103接種于96孔板中，LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染，每天每組取3孔，每孔避光加10 μL CCK-8，37 ℃溫箱溫育2～4 h，Micro-ELISA儀讀取光密度，選擇490 nm波長，測(cè)定各孔吸光值(A)，連續(xù)5 d，記錄結(jié)果，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，A490nm值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

以每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞于6孔板中，第2天分別用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染pEGFP-N1和pEGFP-Aes，用移液槍頭分別在培養(yǎng)板底部呈一字形劃痕，每天觀察并拍照，鏡下記錄劃痕區(qū)細(xì)胞的遷移情況，軟件分析劃痕區(qū)的相對(duì)距離，并計(jì)算其相對(duì)遷移率：(第0天記錄的相對(duì)距離-第3天記錄的相對(duì)距離)/第0天記錄的相對(duì)距離×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力

將BD hanging cell culture inserts置入24孔板中，將BD Matrigel Basement Membrance Matrix 按1∶3的比例用無血清培養(yǎng)基稀釋，取35 μL鋪入小室底層，37 ℃放置2 h使其凝固；收集轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基重懸，將1×104個(gè)細(xì)胞250 μL加入小室，下層培養(yǎng)板中加入700 μL含小牛血清20%的RPMI-1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后用棉簽拭去小室上層細(xì)胞，HE染色，顯微鏡下觀察侵襲的細(xì)胞數(shù)目，分15個(gè)視野對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，用表示，樣本間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Aes在不同肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況

通過RT-PCR和Western blot檢測(cè)肝癌細(xì)胞系HepG2和SMMC-7721中Aes的mRNA和蛋白表達(dá)(圖1)，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于SMMC-7721，Aes在HepG2中的表達(dá)明顯降低。因此，我們?cè)陔S后的試驗(yàn)中選擇HepG2作為研究對(duì)象，觀察了Aes對(duì)HepG2惡性生物學(xué)行為的影響。

2.2 pEGFP-Aes重組蛋白表達(dá)載體構(gòu)建、酶切鑒定

將構(gòu)建好的pEGFP-Aes分別經(jīng)HindⅢ和KpnⅠ酶切后電泳，可見593 bp(Aes編碼區(qū)片段大小)的片段(圖2)。

2.3 pEGFP-Aes在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)鑒定

通過Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)入的pEGFP-Aes的表達(dá)，在熒光顯微鏡下觀察Aes在細(xì)胞中的定位，發(fā)現(xiàn)Aes在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中都有表達(dá)，并且能在細(xì)胞核中形成點(diǎn)狀濃積(圖3)。

2.4 Aes對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2生物學(xué)行為的影響

2.4.1 Aes對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2增殖的影響

將pEGFP-N1、pEGFP-Aes分別轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后，CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，發(fā)現(xiàn)與pEGFP-N1組相比，pEGFP-Aes對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的增殖并無顯著影響(圖4)。

2.4.2 Aes抑制肝癌細(xì)胞HepG2的侵襲能力

同pEGFP-N1組相比，轉(zhuǎn)染了pEGFP-Aes的肝癌細(xì)胞HepG2發(fā)生侵襲的細(xì)胞數(shù)目明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖5，表1)。

2.4.3 Aes抑制肝癌細(xì)胞HepG2的遷移能力

pEGFP-N1組劃痕區(qū)明顯變窄，而pEGFPAes組腫瘤細(xì)胞劃痕間距離基本沒有變化，遷移率明顯降低(P<0.05，圖6，表1)，說明Aes能夠明顯抑制肝癌細(xì)胞遷移。

表 1 pEGFP-Aes對(duì)HepG2侵襲遷移能力的影響Tab.1 The effect of pEGFP-Aes on the invasion and migration of transfected HepG2 cells

3 討 論

Groucho/TLE家族主要是通過與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合來調(diào)控下游基因的表達(dá)，Aes是該家族的重要成員之一，但其本身并不具有DNA結(jié)合位點(diǎn)，在成骨、神經(jīng)及眼的發(fā)育過程中起重要作用［5-7］。早期的研究表明，Aes能夠通過調(diào)節(jié)TCF/LEF-1的活性來激活Wnt信號(hào)通路，從而進(jìn)一步參與調(diào)控發(fā)育［8］。

目前，關(guān)于Aes的報(bào)道較少，其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中所起的作用尚不明確。有研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞質(zhì)中，Aes能與線粒體蛋白Bit1結(jié)合誘導(dǎo)線粒體途徑的細(xì)胞凋亡［9］，近期的研究表明，Aes在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移中扮演重要角色，Aes的表達(dá)缺失可能是導(dǎo)致結(jié)腸癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要因素，但Aes不參與調(diào)控結(jié)直腸腫瘤的生長［4］。

Aes是否在肝癌轉(zhuǎn)移中也起著至關(guān)重要的作用目前尚不清楚。本研究首先檢測(cè)了不同肝癌細(xì)胞系HepG2和SMMC-7721中Aes的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)無論是mRNA水平還是蛋白水平，Aes在HepG2中都比較低，由此我們構(gòu)建pEGFPAes表達(dá)載體，在HepG2細(xì)胞中Aes過表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Aes能夠在細(xì)胞核中形成點(diǎn)狀濃積。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，Aes在細(xì)胞核內(nèi)可以募集轉(zhuǎn)錄因子，形成難溶的轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物，抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄［3］。我們?cè)跓晒怙@微鏡下看到的點(diǎn)狀濃積可能是Aes與其他轉(zhuǎn)錄因子相互結(jié)合抑制基因轉(zhuǎn)錄的復(fù)合物，但Aes結(jié)合的是哪些轉(zhuǎn)錄因子，是否在行使其抑制轉(zhuǎn)錄因子的功能還有待進(jìn)一步研究。此外，轉(zhuǎn)入Aes能夠明顯抑制肝癌細(xì)胞HepG2的侵襲和遷移，在一定程度上逆轉(zhuǎn)腫瘤的惡性生物學(xué)行為。以往研究證明，Aes能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞中Notch信號(hào)通路，而Notch信號(hào)通路與腫瘤的侵襲和遷移有很大聯(lián)系，例如Notch通路中的配體Notch1表達(dá)下調(diào)將會(huì)抑制NF-κB的活性，進(jìn)而抑制VEGF和MMP-9的表達(dá)［10-11］，但此種推斷尚需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn) 證實(shí)?？傊芯緼es在抑制肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移方面所起的重要作用，能夠?yàn)楦伟┑闹委熀皖A(yù)后提供一個(gè)新的靶點(diǎn)。

［1］AKRIVIADIS E A, LLOVET J M, EFREMIDIS S C, et al.Hepatocellular carcinoma ［J］.Br J Surg, 1998, 85(10):1319-1331.

［2］BEAGLE B, JOHNSON G V W.AES/GRG5: More than just a dominant-negative TLE/GRG family member ［J］.Dev Dyn,2010, 239(11): 2795-2805.

［3］SONOSHITA M, AOKI M, FUWA H ,et al.Suppression of colon cancer metastasis by Aes through inhibition of Notch signaling ［J］.Cancer Cell, 2011, 19(1): 125-137.

［4］CHRISTOFORI G.Metastatic colon cancer cells negotiate the intravasation Notch ［J］.Cancer Cell, 2011, 19(1): 6-8.

［5］ZHU C C, DYER M A, UCHIKAWA M, et al.Six3-mediated auto repression and eye development requires its interaction with members of the Groucho-related family of co-repressors［J］.Development, 2002, 129(12): 2835-2849.

［6］ZHANG X, CHEN H M, JARAMILLO E, et al.Histone deacetylase-related protein inhibits AES-mediated neuronal cell death by direct interaction ［J］.J Neurosci Res, 2008,86(11): 2423-2431.

［7］GHOSH-DASTIDAR S, NARAYANAN S, STIFANI S, et al.Transducin-like enhancer of split-1 (TLE1) combines with forkhead box protein G1 (FoxG1) to promote neuronal survival［J］.J Biol Chem, 2012, 287(18): 14749-59.

［8］ROOSE J, MOLENAAR M, PETERSON J, et al.The xenopus Wnt effector XTcf-3 interacts with Groucho-related transcriptional repressors ［J］.Nature, 1998, 395(6702):608-612.

［9］JAN Y, MATTER M, PAI J T, et al.A mitochondrial protein,Bit, mediates apoptosis regulated by integrins and Groucho/TLE corepressors ［J］.Cell, 2004, 116(5): 751-762.

［10］WANG Z, BANERJEE S, LI Y, et al.Down-regulation of notch-1 inhibits invasion by inactivation of nuclear factorkappaB, vascular endothelial growth factor, and matrix metalloproteinase-9 in pancreatic cancer cells ［J］.Cancer Res, 2006, 66(5): 2778-2784.

［11］WANG Z, LI Y, BANERJEE S, et al.Down-regulation of Notch-1 and Jagged-1 inhibits prostate cancer cell growth,migration and invasion, and induces apoptosis via inactivation of Akt, mTOR, and NF-kappaB signaling pathways ［J］.J Cell Biochem, 2010, 109(4): 726-736.