曹志友，歐陽瑾，金 宏，溫 娜，王新成，王 爽＊

（1.吉林醫(yī)藥學(xué)院直屬醫(yī)院，吉林 吉林132013；2.吉林醫(yī)藥學(xué)院 實(shí)驗(yàn)中心）

本研究以Lewis肺癌細(xì)胞為對(duì)象，對(duì)白桃湯劑的抗腫瘤作用進(jìn)行初步研究，為該藥應(yīng)用于臨床提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠Lewis肺癌細(xì)胞（購于中科院上海細(xì)胞庫）。白桃湯劑（吉林醫(yī)藥學(xué)院制備，含核桃皮15g，白附子15g，甘草10g，黃芪20g等），按常規(guī)方法制成1g／ml備用。環(huán)磷酰胺（上海生化制劑廠）。小牛血清、DMEM 培養(yǎng)基、胰酶（GIBCO公司），CO2恒溫孵箱（Thermo Electron公司），倒置顯微鏡（Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇小鼠Lewis肺癌細(xì)胞，用含10%血清的DMEM培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中，37℃，5%CO2，飽和濕度下培養(yǎng)，隔日換液，1∶3傳代。

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法測(cè)定培養(yǎng)上清液中Bcl－2、P53蛋白含量將Lewis細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，以1×105個(gè)／孔細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h，將細(xì)胞分為3組，分別加入白桃湯劑40mg／ml、環(huán)磷酰胺（CTX）10μg／ml，對(duì)照組用基礎(chǔ)培養(yǎng)基。作用24h、48h留上清，將包被液4∶1稀釋后加入96孔酶標(biāo)板中（空白對(duì)照組為100%包被液）4℃過夜；37℃封閉2h。兔抗鼠多克隆Bcl－2、P53抗體（武漢博士德生物工程有限公司）一抗37℃孵育2 h，HRP標(biāo)記的二抗37℃孵育2h，顯色液室溫避光10min；有顏色變化時(shí)終止反應(yīng)，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀492nm處測(cè)定吸光度值（?）。用空白對(duì)照組調(diào)零。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差x—±s表示。組間比較用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 白桃湯劑對(duì)小鼠Lewis肺癌細(xì)胞的抗腫瘤作用

小鼠Lewis肺癌細(xì)胞經(jīng)白桃湯劑作用后，檢測(cè)其培養(yǎng)上清中Bcl－2和P53表達(dá)，發(fā)現(xiàn)上清中Bcl－2蛋白含量在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)均有明顯降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），并隨時(shí)間延長作用更加明顯。與環(huán)磷酰胺組對(duì)比，白桃湯劑作用后抑制Bcl－2蛋白表達(dá)更顯著。而P53蛋白在作用48h后下降有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1、2。

表1 白桃湯劑作用于小鼠Lewis肺癌細(xì)胞上清中Bcl－2表達(dá)水平檢測(cè)（x—±s）

表2 白桃湯劑作用于小鼠Lewis肺癌細(xì)胞上清中P53表達(dá)水平檢測(cè)（x—±s）

3 討論

隨著中藥的發(fā)展，中藥治療腫瘤也開始投入更多的財(cái)力和物力。民間秘方白桃湯劑對(duì)Lewis肺癌模型小鼠腫瘤生成具有明顯的抑瘤作用，藥物作用于動(dòng)物后可引起血清TNF－α水平升高、IL－6水平降低，進(jìn)而提高機(jī)體的免疫功能［1］。白桃湯劑也可以通過降低移植瘤VEGF的表達(dá)率，抑制小鼠肺癌血管生成從而抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移來發(fā)揮其抗腫瘤作用［2］。本實(shí)驗(yàn)在以往研究的基礎(chǔ)上，對(duì)白桃湯劑的抗腫瘤作用機(jī)制作進(jìn)一步研究，以明確其抗腫瘤機(jī)制。

我們對(duì)小鼠Lewis肺癌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，用ELISA方法對(duì)白桃湯劑作用細(xì)胞后上清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：小鼠Lewis肺癌細(xì)胞經(jīng)白桃湯劑作用后，其培養(yǎng)上清中Bcl－2蛋白含量在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)均有明顯降低，并隨時(shí)間延長作用更加明顯。而P53蛋白在作用48h后也下降，與環(huán)磷酰胺組對(duì)比，白桃湯劑作用后抑制Bcl－2、P53蛋白表達(dá)更顯著。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡在腫瘤多種治療方法中占有重要的地位，Bcl－2、P53等均參與了細(xì)胞凋亡的調(diào)控［3］，在肺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起到了重要的作用［4］。而其它抗癌物質(zhì)如海藻硫酸多糖對(duì)肺癌增殖的抑制作用可能是通過Bcl－2、P53等均參與了細(xì)胞凋亡的調(diào)控而發(fā)揮作用［5］。因此，通過實(shí)驗(yàn)我們初步驗(yàn)證了白桃湯劑可能是通過Bcl－2、P53等調(diào)控腫瘤的生長，但其具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

［1］曹志友，王 爽，歐陽瑾，等.白桃湯劑治療Lewis肺癌小鼠的實(shí)驗(yàn)研究［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2009，20（4）：914.

［2］歐陽瑾，曹志友，王 爽，等.白桃湯劑抑制小鼠Lewis肺癌移植瘤的生長及其血管生成的實(shí)驗(yàn)研究［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2009，20（10）：2476.

［3］Rom WN，Hay JY，Lee TC，et al.Molecular and genetic aspects of lung cancer［J］.AmJ Respir Crit Care Med，2000，161：1355.

［4］張晨策，魏煜程，沈 毅.非小細(xì)胞肺癌組織P53、P16和Bcl－2蛋白表達(dá)及意義［J］.齊魯醫(yī)學(xué)雜志，2011，26（4）：302.

［5］翟振國，蔣捍東，秦筱梅，等.海藻硫酸多糖對(duì)肺癌增殖的抑制作用及其機(jī)制［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2004，27（2）：97.