徐 躍，宋敏國，楊仙玉，袁進強

（浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 臨安 311300）

半乳糖凝集素（galectins）是動物凝集素的一類，具有高度保守的糖識別結(jié)構(gòu)域（carbohydrate recognition domain，CRD），能特異性識別并結(jié)合β-半乳糖苷[1]。目前，已從動物組織和細胞中分離到15個galectin家族的成員，在細胞核、細胞質(zhì)、細胞表面、細胞基質(zhì)和生物體液中都有發(fā)現(xiàn)[2]。galectin-3（gal-3）是該家族中唯一的嵌合型代表[1]，作為一個多功能蛋白，參與胚胎發(fā)育、細胞黏附和增殖、凋亡、mRNA剪切、細菌定植、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等[3-7]。該蛋白由3個不同的結(jié)構(gòu)域組成：①12個氨基酸殘基組成的N-端結(jié)構(gòu)域，其中ser6磷酸化位點具有調(diào)節(jié)細胞靶向的作用；②富含甘氨酸（gly），酪氨酸（tyr）和脯氨酸（pro）串聯(lián)重復(fù)序列的類膠原結(jié)構(gòu)，作為基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）的底物；③140個氨基酸殘基組成的CRD，包含凋亡基因Bcl-2家族同源序列BH1中的保守基序NWGR（asp-trp-gly-arg），該基序被認為是抑制凋亡活性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)[6，8]。gal-3通過糖基識別系統(tǒng)與細胞表面受體多糖的結(jié)合和交聯(lián)，從而介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[2]，在不同的生物過程中發(fā)揮作用。CRD區(qū)域包含與晚期糖基化終末產(chǎn)物（advancedglycation end products，AGEs）結(jié)合的位點，和全部的糖基結(jié)合位點，因此被認為是gal-3凝集功能的活性中心[2]。本實驗室從中華大蟾蜍Bufo gargarizans皮膚中克隆到一個galectin-3基因（登陸號：AEX58672.1）[9]，并在后續(xù)實驗中共獲得了9個不同的galectin-3 cDNA克隆。本研究對其核苷酸序列以及推導(dǎo)蛋白質(zhì)的氨基酸序列進行比對和分析，將有助于了解中華大蟾蜍對環(huán)境適應(yīng)性的機制及gal-3蛋白的生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

健康中華大蟾蜍采自浙江農(nóng)林大學(xué)東湖校區(qū)。將蟾蜍體表沖洗干凈，處死后剝離皮膚，投入液氮中冷凍，保存在-70℃超低溫冰箱中備用。

1.2 主要材料和試劑

大腸埃希菌Escherichia coli感受態(tài)細胞DH5α，聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）試劑盒，Quantscript RT kit及pGM-T載體購自Tiangen公司，限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ購自Takara，脫氧核糖核酸（DNA）梯度和質(zhì)粒小量抽提試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所，核糖核酸（RNA）提取試劑盒購自上海博彩生物技術(shù)公司。

1.3 方法

1.3.1 引物 上游引物P1為：5′-ATGTCTGACGGCTTTTCG-3′；下游引物P2為：5′-TTACACTGTAGTTAAGGAAG-3′，均由上海桑尼生物科技有限公司合成[9]。

1.3.2 皮膚總RNA的制備 取中華大蟾蜍皮膚組織，按RNA提取試劑盒說明提取皮膚組織總RNA，瓊脂糖電泳檢測RNA的完整性，用紫外分光光度計檢測RNA溶液濃度和純度。

1.3.3 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 采用Quantscript RT kit（cDNA第1鏈合成試劑盒）合成第1鏈cDNA。

1.3.4 PCR擴增galectin-3基因片段 以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA第1鏈為模板進行PCR，各反應(yīng)成分如下：cDNA 模板 1.0 μL， 10 × PCR 緩沖液 1.0 μL， 氯化鎂（25mmol·L-1）1.2 μL， 使用引物 P1 和 P2（2μmol·L-1）各1.0 μL， 脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）（10mmol·L-1）0.8 μL， Taq 酶（5×16.67 mkat·L-1）0.2 μL， 補加滅菌去離子水至20.0 μL。反應(yīng)條件為：94℃ 5 min，（94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 45 s）×30循環(huán)，72℃ 8 min。 使用 10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR 產(chǎn)物（5.0 μL）。

1.3.5 pGM-T載體連接和轉(zhuǎn)化 PCR產(chǎn)物0.5 μL，pGM-T 1.0 μL，2×T4 DNA快速連接緩沖液5.0 μL，T4 Ligase 1.0 μL，滅菌去離子水補足至10.0 μL，23℃連接10 min。連接產(chǎn)物2.0 μL電擊轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌 DH5α感受態(tài)細胞中（40.0 μL），迅速加入160.0 μL LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)液，37℃振蕩培養(yǎng)45 min，取50.0 μL培養(yǎng)液均勻涂布于含氨芐青霉素（100 mg·L-1），異丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG，24 mg·L-1）， 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal， 40 mg·L-1）的 LB 平板， 37 ℃倒置培養(yǎng)過夜。

1.3.6 重組質(zhì)粒的鑒定和序列測定 從LB平板隨機挑取16個白色單克隆，接種于3.5 mL LB培養(yǎng)液中（含氨芐青霉素100 mg·L-1），37℃振蕩培養(yǎng)過夜，質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒，并對質(zhì)粒進行DNA限制性內(nèi)切酶 EcoRⅠ消化。 酶切反應(yīng)體系10.0 μL： 質(zhì)粒1.0 μL，10×K 緩沖液1.0 μL，EcoRⅠ0.2 μL，滅菌去離子水補足至10.0 μL；37℃1 h。取5.0 μL酶切產(chǎn)物進行10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳，確定陽性克隆及質(zhì)粒的濃度，制備DNA測序樣品。

1.3.7 DNA測序與序列分析 將確定為陽性的重組質(zhì)粒命名為pGM-T-gal-3，委托上海桑尼有限公司使用載體上游引物T7和下游引物SP6對目的基因片段分別進行正向和反向測序。測序結(jié)果經(jīng)美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）的ORF Finder程序（http： //www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/orfig.cgi）查找galectin-3基因的ORF，推導(dǎo)出氨基酸序列。Clustal X2.0多序列比對用于蟾蜍皮膚galectin-3 cDNA序列多樣性分析與氨基酸位點突變分析；運用DnaSP 4.0軟件分析核苷酸多樣性；利用MEGA 4.0軟件構(gòu)建進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序結(jié)果

使用ORF Finder程序分析序列，獲得9個不同的中華大蟾蜍galectin-3克隆，分別命名為：gal-3-1，gal-3-2， gal-3-3， gal-3-5， gal-3-6， gal-3-7， gal-3-9， gal-3-11， gal-3-13， 編碼區(qū)長度分別為 804， 789，759， 735， 798， 522， 732， 552 和 729 bp， 各自編碼 267， 262， 252， 244， 265， 173， 243， 183 和242個氨基酸殘基（圖1～2）。其中g(shù)al-3-7和gal-3-11編碼N-端截短型蛋白。本研究選擇編碼galectin-3C（N端截短型galectin-3）區(qū)域的522 bp進行比對分析（圖1）。

2.2 N-端缺失突變

與gal-3-1相比，gal-3-7和gal-3-11在ORF的5′端前缺失了部分核苷酸，導(dǎo)致閱讀框架發(fā)生改變，從而使gal-3-7和gal-3-11編碼的蛋白在N端失去了部分氨基酸殘基，翻譯產(chǎn)物對應(yīng)gal-3C。gal-3-7和gal-3-11分別由522和552個堿基組成，各自編碼由173和183個氨基酸組成的蛋白質(zhì)（圖1～2）。N-端缺失突變體的發(fā)現(xiàn)將為galectin-3結(jié)構(gòu)與組成的研究提供參考。

2.3 分子多樣性

以gal-3-1 cDNA序列為標準，進行了核苷酸變異位點的分析（表1）。在galectin-3 C-端的522 bp區(qū)域共檢測到26個變異位點，約占分析位點的4.98%，11個為非同義突變，15個為同義突變，平均每20 bp出現(xiàn)1個SNP，呈現(xiàn)出高密度的單核苷酸多態(tài)性（SNP）。SNP的主要原因包括堿基轉(zhuǎn)換與顛換、插入與缺失（圖1）。9個cDNA序列之間除了個別核苷酸位點發(fā)生了突變外，gal-3-6在81～89 bp間插入了“TCCAACTGC”序列（圖 1）。

表1 中華大蟾蜍galctin-3C基因編碼區(qū)核苷酸多樣性分析Table1 Analysis of nucleotide diversity in galectin-3C coding region of Bufo gargarizans

用軟件DnaSP 4.0對galectin-3C基因序列進行了中性檢驗，9個樣本的平均核苷酸差異數(shù)為7.16667，核苷酸多樣度為1.37%，進行Tajima’s D，F(xiàn)u-Li’s F，F(xiàn)u-Li’s D檢驗，3種中性檢驗值均為負值且未達到顯著水平（P＞0.10），表明galectin-3C序列符合中性突變假說，呈中性進化。

2.4 氨基酸位點突變

多序列比對分析，發(fā)現(xiàn)中華大蟾蜍與人的gal-3在N端前16個氨基酸位點相當保守。gal-3在富含酪氨酸，脯氨酸和甘氨酸的串聯(lián)重復(fù)序列中保守性較差，彼此之間表現(xiàn)出較大的差異性。在中華大蟾蜍gal-3中發(fā)現(xiàn)大量富含酪氨酸，脯氨酸和甘氨酸的串聯(lián)重復(fù)序列“QP（A）QQY（F）PG”和“QQYPG”，且在各序列中的重復(fù)頻率不同，可能暗示了gal-3是從富含脯氨酸/甘氨酸單元的祖先進化幾次之后而來的。中華大蟾蜍與哺乳動物gal-3氨基酸序列存在差異，但在糖基結(jié)合關(guān)鍵位點和基序上與人gal-3蛋白具有一定的保守性。中華大蟾蜍gal-3在ser6上高度保守，可能是其磷酸化位點。對中華大蟾蜍gal-3的糖識別結(jié)構(gòu)域（CRD）氨基酸序列進行分析發(fā)現(xiàn)：保守基序HFNPRF在中華大蟾蜍gal-3蛋白中變異為HCNPRF，而另一保守基序WGXEXR在中華大蟾蜍gal-3 CRD中高度保守。

2.5 中華大蟾蜍galectin-3的進化樹分析

以 Xenopus（Silurana） tropicalis（NP_988986.1）和 Xenopus laevis （NP_001079643.1）的氨基酸序列為外群，與本實驗獲得的9個中華大蟾蜍galectin-3的cDNA推導(dǎo)的氨基酸序列構(gòu)建了N-J系統(tǒng)進化樹（圖3）。結(jié)果顯示本研究中的9個克隆聚為一枝，與Xenopus（Silurana）tropicalis和Xenopus laevis的galectin-3分屬2枝。提示中華大蟾蜍與Xenopus（Silurana）tropicalis和Xenopuslaevis的galectin-3之間存在種屬差異性。

圖1 中華大蟾蜍編碼galectin-3C的cDNA多序列比對Figure1 Multiple sequence alignment of cDNAs of galectin-3C of Bufo gargarizans

圖2 中華大蟾蜍編碼galectin-3多序列氨基酸比對Figure2 Multiple sequence alignment of amino acid sequences of galectin-3 of Bufo gargarizans

3 討論

3.1 galectin-3分子多樣性與兩棲類動物的生物學(xué)適應(yīng)意義

兩棲類動物皮膚裸露、潮濕，利于微生物生長，為了抵御病原微生物的侵襲，在長期自然進化過程中形成了獨特的防御微生物侵襲機制[10]。兩棲類皮膚功能基因組具有多樣性豐富、快速重組突變的特征，是探討生物適應(yīng)的基因基礎(chǔ)、基因形成機制和進化特性等生物學(xué)基本問題的優(yōu)秀模型[11]。有研究表明，一些生物有機體能快速地改變表型特征來適應(yīng)各種逆境的環(huán)境，就是與基因中的重復(fù)序列在DNA和RNA或者蛋白質(zhì)合成過程中產(chǎn)生的滑動錯配而誘導(dǎo)產(chǎn)生有關(guān)[12]。

本實驗發(fā)現(xiàn)在同一個中華大蟾蜍個體中出現(xiàn)多個不同galectin-3序列的情況，呈現(xiàn)出分子多樣性（圖1和表1），從而導(dǎo)致了gal-3在氨基酸組成上的多樣性（圖2），這或許是生物快速適應(yīng)外界環(huán)境變化的分子基礎(chǔ)。本研究的研究結(jié)果與前人對大蹼鈴蟾Bombina maxima皮膚分泌物Maximin及Maximin H抗菌肽分子多樣性，滇蛙Rana pleuraden皮膚抗感染多肽cDNA序列多樣性，黑帶蛙Rana nigrovittata皮膚中緩激肽類似肽（bradykinin-related pepetides，BRP）結(jié)構(gòu)多樣性等的研究結(jié)果共同揭示了兩棲動物的生物學(xué)適應(yīng)的分子生物學(xué)機制[11，13-14]。

圖3 中華大蟾蜍和爪蟾galectin-3分子進化樹Figure3 Phylogenetic tree of galectin-3 composed by comparing Bufo gargarizans with two Xenopus spp.

3.2 中華大蟾蜍gal-3的功能預(yù)測

推導(dǎo)的氨基酸序列比對顯示這9個序列在串聯(lián)重復(fù)區(qū)存在較大差異，主要是重復(fù)單元 “QP（A）QQY（F）PG”和“QQYPG”出現(xiàn)頻率不同（圖2），但與人gal-3在N端和CRD域有較高一致性，主要表現(xiàn)在磷酸化位點、糖基結(jié)合位點和相關(guān)基序上。

中華大蟾蜍與人的gal-3在N端前16個氨基酸位點相當保守（圖2）。有研究表明：缺失開始的11個氨基酸會導(dǎo)致gal-3的分泌封閉[15]，而ser6在哺乳動物gal-3中承擔著調(diào)節(jié)成纖維細胞的磷酸化的任務(wù)[16-17]，磷酸化可以大大降低gal-3與多價配基的結(jié)合[18]。ser6是酪蛋白激酶I（CKI）在體外的有效底物[19]，并且ser6附近保守的asp3對于CKI底物的識別非常重要[20]。而突變ser6則封閉了gal-3抑制失巢凋亡（anoikis）的能力[21]。氨基酸序列比對表明，中華大蟾蜍gal-3在ser6與asp3高度保守（圖2），可能具有類似哺乳動物gal-3中ser6磷酸化位點的功能。

gal-3在糖識別結(jié)構(gòu)域（CRD）的保守性主要表現(xiàn)在糖基結(jié)合位點和相關(guān)基序上。不同galectins之間CRD的氨基酸序列存在差異，但它們都享有2個保守的氨基酸基序HFNPRF和WGXEXR（X為任意氨基酸）。HFNPRF基序中的組氨酸（H），天門冬酰胺（N）和精氨酸（R），WGXEXR基序中的色氨酸（W），谷氨酸（E）和精氨酸（R）已經(jīng)被X-射線晶體衍射和氨基酸定點突變證明它們參與galectins的糖結(jié)合過程[22]。我們對來自中華大蟾蜍和人的gal-3 CRD氨基酸序列進行分析發(fā)現(xiàn)：人gal-3蛋白中存在的保守基序HFNPRF，在中華大蟾蜍gal-3蛋白中變異為HCNPRF，所有g(shù)al-3氨基酸序列中均存在保守基序WGXEXR（圖2）。核磁共振顯示，配體能誘導(dǎo)人gal-3糖基結(jié)合位點附近回路（loop環(huán)）的構(gòu)象改變，163～169位氨基酸之間的回路（FNENNRR）并不直接參與糖基結(jié)合，但在凋亡機制中對調(diào)節(jié)gal-3與其他蛋白作用是必需的，177～184位氨基酸間的回路（LDNNWGRE）包含NWGR基序，直接參與糖基結(jié)合[23]。中華大蟾蜍gal-3在這2個回路的氨基酸位點上保守性略低（圖2），是否影響到這些區(qū)域的功能還有待研究。X-射線衍射分析表明：人gal-3的關(guān)鍵糖基結(jié)合位點有arg144，his158，asn160，arg162，glu165，asn174，trp181，glu184和arg186[24]。通過多序列對比分析，發(fā)現(xiàn)中華大蟾蜍的9條推導(dǎo)氨基酸序列在9個關(guān)鍵糖基結(jié)合位點上完全保守（圖2），預(yù)測中華大蟾蜍gal-3具有結(jié)合糖基的功能。

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