宋 雙，黃銀芝，董雷鳴，黃有軍，曾燕如，吳智敏

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江 臨安 311300；2.浙江省龍泉市林業(yè)局，浙江 龍泉 323700）

簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR）是一類一般由1～6個(gè)堿基組成的基元重復(fù)串聯(lián)而成的脫氧核糖核酸（DNA）序列[1]，基元重復(fù)次數(shù)一般為10～50，同一類微衛(wèi)星DNA可分布在基因組的不同位置上；基因組中SSR多態(tài)性較豐富，呈共顯性遺傳，所以可提供的信息量較高，結(jié)果穩(wěn)定可靠[2]。SSR標(biāo)記分為兩大類，即基因組SSR（genomic SSR）和表達(dá)序列標(biāo)簽SSR（expression sequence tag-SSR，ESTSSR）?；蚪MSSR是基于基因組序列開發(fā)的，采用構(gòu)建基因組文庫的方法，開發(fā)耗時(shí)費(fèi)力，而且因?yàn)樘结樀木壒?，種類有一定的局限性；EST-SSR是指存在于基因表達(dá)序列內(nèi)的SSR，不包括存在于內(nèi)含子及非表達(dá)調(diào)控區(qū)之中的SSR[3-4]，它基于cDNA文庫的構(gòu)建及cDNA測(cè)序。Scott等[5]從5000條葡萄屬Vitis EST中開發(fā)了124個(gè)SSR。EST-SSR標(biāo)記不僅具有基因組SSR標(biāo)記多態(tài)性高、共顯性、重復(fù)性好的特點(diǎn)，而且開發(fā)成本相對(duì)低廉，在種屬間具有良好的通用性[6]。另外，由于部分EST-SSR標(biāo)記來自于基因的編碼區(qū)，所以更容易獲得基因表達(dá)的信息，可為功能基因的直接鑒定提供重要依據(jù)[7]。目前，該分子標(biāo)記已被廣泛應(yīng)用于品種指紋鑒定[8-9]、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建[10-11]、遺傳多樣性分析[12-13]和分子標(biāo)記輔助育種[2，14-15]， 在諸如小麥 Triticum aestivum[16-17]， 大豆 Glycine max[18-19]， 葡萄 Vitis vinifera[5]， 胡椒 Lindera sp.[20]， 白菜 Brassica campestris[21]， 水稻 Oryza sativa[22]， 獼猴桃 Actinidia chinensis[23]等植物中已成功開發(fā)了EST-SSR標(biāo)記，但尚無山核桃Carya cathayensis EST-SSR標(biāo)記的報(bào)道。山核桃是浙江省重要的經(jīng)濟(jì)樹種。近年來隨著研究的深入，已陸續(xù)在山核桃中建立了擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）[24]， 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài) DNA （random amplified polymorphic DNA， RAPD）[25]， 微衛(wèi)星間隔片段多態(tài)性（inter-simple sequence repeat， ISSR）[26]， 序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性 SRAP（sequence-related amplified polymorphism，SRAP）[27]標(biāo)記分析體系，并將它們應(yīng)用于山核桃遺傳研究。研究發(fā)現(xiàn)：將這些標(biāo)記應(yīng)用于天然群體山核桃樣品的分析，多態(tài)性總是不豐富[26-29]。這一方面與山核桃本身的遺傳特性有關(guān)，另一方面與分子標(biāo)記本身的局限性有關(guān)。上述分子標(biāo)記均為顯性標(biāo)記，不能區(qū)分顯性純合位點(diǎn)與顯性雜合位點(diǎn)，盡管SRAP相對(duì)而言可顯示部分共顯性[30-31]。因此，有必要開發(fā)諸如SSR的山核桃共顯性標(biāo)記，以深化山核桃的遺傳研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 EST-SSR引物設(shè)計(jì)的數(shù)據(jù)源 黃銀芝等[32]以山核桃果實(shí)油脂形成、轉(zhuǎn)化、積累關(guān)鍵時(shí)期的果實(shí)為材料，構(gòu)建了一個(gè)滴度為5.0×109空斑形成單位（pfu）·mL-1的山核桃脂肪代謝相關(guān)cDNA文庫，并對(duì)部分cDNA片段進(jìn)行了克隆測(cè)序。以序列分析中發(fā)現(xiàn)的含有SSR堿基重復(fù)特點(diǎn)的序列作為EST-SSR引物設(shè)計(jì)的數(shù)據(jù)源。

1.1.2 供試山核桃 5月，山核桃幼葉充分展開后，在山核桃產(chǎn)區(qū)采集40個(gè)單株的葉片，各單株在同一地點(diǎn)彼此間至少相距100 m。采樣地點(diǎn)主要分布在山核桃主產(chǎn)區(qū)浙江省臨安市的島石、馬嘯、頰口、昌化、龍崗、橫路、順溪、湍口等地，所有單株均為野生成年大樹。

1.2 方法

1.2.1 EST-SSR引物的設(shè)計(jì) 對(duì)含有SSR堿基重復(fù)特點(diǎn)的cDNA序列，利用Primer Premier 5（http：//www.premierbiosoft.com/crm/jsp/com/pbi/crm/clientside/ProductList.jsp）進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。參照軟件說明書設(shè)置引物設(shè)計(jì)參數(shù)：產(chǎn)物長(zhǎng)度為100～300 bp；引物長(zhǎng)度為18～25 bp；退火溫度為45～65℃，且上下游引物的退火溫度相差不大于5℃；引物堿基（GC）為40%～60%；盡量避免引物二級(jí)結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。

1.2.2 DNA的提取 借鑒郭金劍[29]建立的適用于山核桃葉片DNA的提取方法，即改良十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取基因組DNA。DNA經(jīng)吸光度值D（λ）測(cè)定及電泳檢測(cè)，質(zhì)量達(dá)到要求的稀釋到100 mg·L-1用于 SSR 分析。

1.2.3 SSR反應(yīng)體系的優(yōu)化 本研究在郭金劍[29]建立的適用于山核桃的SSR反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上，根據(jù)實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的現(xiàn)象，對(duì)DNA模板用量及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，得到山核桃SSR最佳反應(yīng)體系。

1.2.4 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)及SSR引物篩選 EST-SSR引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。先取3個(gè)樣品的DNA對(duì)引物進(jìn)行粗篩，即用優(yōu)化的SSR反應(yīng)與擴(kuò)增體系擴(kuò)增DNA后，通過10.0 g·L-1的瓊脂糖凝膠電泳分離，檢測(cè)引物是否有擴(kuò)增產(chǎn)物。對(duì)有擴(kuò)增產(chǎn)物的引物對(duì)，再用來自天然群體的40個(gè)山核桃單株樣品進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物采用100.0 g·L-1非變性聚丙烯酰胺凝膠，在1×三羥基氨基甲烷-硼酸（TBE）電泳緩沖液中150 V恒壓電泳1.5～2.0 h；電泳結(jié)束后，凝膠用蒸餾水清洗1 min；隨后2.0 g·L-1的硝酸銀和體積分?jǐn)?shù)為10%乙醇溶液固定銀染10 min；再用蒸餾水漂洗2次，2 min·次-1，后在20.0 g·L-1氫氧化鈉和體積分?jǐn)?shù)為0.4%甲醛混合溶液中顯色，最后清水漂洗凝膠，并在BIO-RAD GS800成像系統(tǒng)中拍照保存。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 由于SSR為共顯性標(biāo)記，可以區(qū)分顯性純合子和顯性雜合子，因此電泳結(jié)果按照共顯性標(biāo)記的讀帶方法：若條帶間距離在20 bp以內(nèi)，則視為1個(gè)雜合位點(diǎn)，2條帶分別讀為A，B帶；若20 bp以內(nèi)只有1個(gè)條帶，則視為純合位點(diǎn)，讀為AA或BB。

1.2.6 山核桃SSR標(biāo)記與其它標(biāo)記分析結(jié)果的比較 本課題組已建立了山核桃AFLP，RAPD，ISSR，SRAP標(biāo)記分析體系。本研究將SSR開發(fā)的初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其余4種標(biāo)記體系分析的結(jié)果進(jìn)行了比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 EST-SSR引物的設(shè)計(jì)

從1010個(gè)測(cè)序的cDNA克隆中得到了188條非冗余序列，發(fā)現(xiàn)43個(gè)cDNA序列具有SSR堿基重復(fù)特點(diǎn)。利用Primer Premier 5進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，其中基于9個(gè)cDNA序列設(shè)計(jì)的引物達(dá)不到設(shè)置的引物參數(shù)要求。因此，最后共設(shè)計(jì)SSR引物34對(duì)（表1）。

表1 開發(fā)的山核桃SSR引物序列及在供試樣品中檢測(cè)到的總位點(diǎn)數(shù)Table1 Sequences of the SSR primers developed and the total loci detected in Carya cathayensis

表1 （續(xù)）

2.2 DNA的提取

從供試樣品中提取的基因組DNA D（λ）260/D（λ）280都為1.8～2.0，且DNA電泳條帶明亮、清晰，純度較高，可用于后續(xù)SSR分子標(biāo)記的分析。

2.3 SSR體系的優(yōu)化

經(jīng)過試驗(yàn)過程不斷優(yōu)化，最終PCR產(chǎn)物電泳的擴(kuò)增條帶清晰，無拖尾、條帶很粗，確定10.0 μL的PCR反應(yīng)體系為：10×緩沖液 （buffer）1.0 μL，氯化鎂 （MgCl2）1.0 μL，三磷酸堿基脫氧核苷酸 （dNTP）0.3 μL， SSR 正反向引物（濃度為 10μmol·L-1）各 0.5 μL， Taq DNA 聚合酶 0.1 μL（上海申能博彩生物科技有限公司）， 模板 DNA（100 mg·L-1） 0.5 μL， 加無菌雙蒸水（ddH2O）至終體積 10.0 μL； PCR 擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5 min；隨后30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)94℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸60 s；最后72℃延伸3 min，其中退火溫度各引物對(duì)有所不同（表1）。與郭金劍[29]建立的山核桃SSR體系相比較，本實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系中的緩沖液用量減少了0.5 μL，Taq DNA聚合酶用量減少了0.1 μL，DNA用量減少了200 ng；郭金劍在其實(shí)驗(yàn)中使用了30.0 g·L-1的瓊脂糖凝膠，而在本實(shí)驗(yàn)中采用的是分辨率更佳的非變性聚丙酰胺凝膠電泳（PAGE）。因此，反應(yīng)體系中一些組分的用量有所減少，而電泳結(jié)果更加清晰。

基于各SSR引物對(duì)在3個(gè)DNA樣品中的擴(kuò)增結(jié)果，在瓊脂糖凝膠中對(duì)引物對(duì)進(jìn)行了初步的篩選。34對(duì)引物中有4對(duì)引物無擴(kuò)增產(chǎn)物（圖1）。對(duì)有擴(kuò)增產(chǎn)物的引物對(duì)，用40個(gè)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物采用非變性PAGE電泳，結(jié)果30對(duì)引物有擴(kuò)增產(chǎn)物（圖2），但其中3對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物在500 bp以上。按照引物設(shè)計(jì)的參數(shù)，預(yù)期的擴(kuò)增產(chǎn)物為100～300 bp。因此，這3對(duì)引物的擴(kuò)增屬非特異性擴(kuò)增。最終確認(rèn)可用的SSR引物為27對(duì)（表1）。

圖1 山核桃SSR引物初步篩選電泳圖（部分）Figure1 Preliminary screening of SSR primers in Carya cathayensis （partial）

圖2 山核桃SSR標(biāo)記分析電泳圖（部分；引物對(duì)：SSR34）Figure2 Electrophorogram of SSR markers in Carya cathayensis （partial； primer pair： SSR34）

此外，在可用的27對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物中，按照重復(fù)基元的種類劃分，可將引物分為3種重復(fù)基元的引物，其中二核苷酸重復(fù)基元出現(xiàn)的頻率最高，為66.7%；其次分別為三核苷酸和四核苷酸重復(fù)，它們分別占30%和3.3%。二堿基重復(fù)基元中出現(xiàn)頻率較多的重復(fù)基元是（A/T）n和（T/C）n，它們各占二核苷酸重復(fù)基元引物的35%和45%（表2）。

表2 山核桃EST-SSR引物擴(kuò)增產(chǎn)物的重復(fù)基元特性Table2 Repeat contigs of SSR primer-amplified products in Carya cathayensis

2.4 SSR標(biāo)記與其他標(biāo)記分析結(jié)果的比較

27對(duì)SSR引物對(duì)40個(gè)山核桃樣品進(jìn)行分析，共擴(kuò)增得到46個(gè)位點(diǎn)，平均每對(duì)引物產(chǎn)生1.7個(gè)位點(diǎn)，其中雜合位點(diǎn)28個(gè)，占總位點(diǎn)數(shù)的60.9%；純合位點(diǎn)18個(gè)，占位點(diǎn)數(shù)的39.1%。27對(duì)引物中有18對(duì)在供試樣品中擴(kuò)增出22個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，占總位點(diǎn)數(shù)的47.8%。

與本課題組建立或優(yōu)化的山核桃其他分子標(biāo)記[28-29，33]相比較，SSR標(biāo)記多態(tài)性位點(diǎn)的比例較高，且能夠區(qū)分顯性純合位點(diǎn)及顯性雜合位點(diǎn)外，但其余各指標(biāo)均不如顯性標(biāo)記（表3）。SSR多態(tài)性產(chǎn)生的機(jī)制是因?yàn)镈NA復(fù)制和修復(fù)過程中堿基的滑動(dòng)、錯(cuò)配或減數(shù)分裂過程中姊妹染色單體的不均等交換[34]；山核桃EST-SSR標(biāo)記檢測(cè)的位點(diǎn)數(shù)為1～3個(gè)，遠(yuǎn)不如其他顯性標(biāo)記。當(dāng)然，多態(tài)性分析反映的是物種的遺傳多樣性，與該物種的本質(zhì)特性有關(guān)。因此，利用SSR分析研究遺傳多樣性時(shí)，為獲得一定數(shù)量的多態(tài)位點(diǎn)用于遺傳分析，通常所需的SSR引物較多。對(duì)山核桃而言，還需繼續(xù)開發(fā)SSR引物。

表3 山核桃各種分子標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果的比較Table3 Comparison among the amplification results of various molecular markers in Carya cathayensis

3 討論

Silva等[35]通過研究甘蔗Saccharum sinensis EST，設(shè)計(jì)了20對(duì)EST-SSR引物，并利用這些引物研究了甘蔗栽培種和甘蔗屬Saccharum內(nèi)種間的多態(tài)性，結(jié)果表明EST-SSR具有較高的種間保守性。鑒于SSR標(biāo)記的共顯性及種屬特異性，其開發(fā)的成本往往較高，因涉及文庫的構(gòu)建及序列的測(cè)定。本研究基于cDNA文庫構(gòu)建及部分測(cè)序結(jié)果，開發(fā)了27對(duì)山核桃EST-SSR引物，為后續(xù)SSR引物的進(jìn)一步開發(fā)打下了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。山核桃SSR標(biāo)記的進(jìn)一步開發(fā)，可以在現(xiàn)有文庫cDNA測(cè)序的基礎(chǔ)上繼續(xù)進(jìn)行。此外，黃有軍[36]以山核桃雌花成花過程的花芽RNA為材料，結(jié)合454測(cè)序，共獲得了1575個(gè)具有SSR堿基重復(fù)特點(diǎn)的序列。這些材料都可以作為山核桃EST-SSR標(biāo)記進(jìn)一步開發(fā)的數(shù)據(jù)源。

cDNA為基因表達(dá)過程產(chǎn)生的mRNA反轉(zhuǎn)錄而來，不含內(nèi)含子序列。不同物種同一基因cDNA序列進(jìn)行比對(duì)時(shí)或多或少具有一定的相似性。因此，理論上基于EST序列開發(fā)的SSR引物對(duì)的通用性要優(yōu)于基于基因組文庫開發(fā)的SSR引物對(duì)，盡管仍存在種屬特異性的特點(diǎn)。本研究小組正在進(jìn)行山核桃與美國(guó)山核桃Carya illinoinensis正反交研究，擬將從山核桃中開發(fā)的EST-SSR標(biāo)記用于同屬兩物種正反交子代的分析，進(jìn)一步驗(yàn)證所開發(fā)標(biāo)記的通用性。

本研究對(duì)山核桃EST-SSR標(biāo)記進(jìn)行了開發(fā)，初步獲得27對(duì)可用的SSR引物。研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果將為深入研究山核桃的遺傳多樣性、種質(zhì)資源評(píng)價(jià)等奠定基礎(chǔ)。

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