郭 明，武曉鵬，孫東海，周建鐘，張 華

（浙江農林大學 理學院，浙江 臨安 311300）

重金屬污染具有多源性、隱蔽性、污染后果嚴重等特點，重金屬殘留對人類健康造成危害而不易被人們察覺[1-3]，因而成為環(huán)境污染研究的熱點和難點問題。目前，重金屬污染呈上升趨勢[4]，林果產品等涉林食品中的重金屬殘留問題也逐漸顯現(xiàn)，重金屬殘留分析檢測受到充分重視，投入大量資金和人力來開發(fā)和應用重金屬殘留含量分析新技術，其中，樣品前處理是關鍵點。當前常用的樣品前處理技術如萃取、層析、蒸餾等[5]方法較為成熟，但存在操作繁瑣、處理周期長、重復性差、使用大量有機溶劑造成環(huán)境二次污染等缺點。因此，研究成本低、操作簡便、高效率、高選擇性的樣品分離/分析技術，已成為當今重金屬殘留含量分析檢測的前沿課題[6]?；|固相萃?。╩atrix solid-phase dispersion，MSPD）技術是近年迅速發(fā)展起來的一種固液分離萃取樣品新技術，其將吸附材料直接與待測樣品混合研磨后作為吸附基質裝柱，再通過溶劑洗脫、濃縮等完成樣品預處理[7-8]。該方法處理樣品具有靈活、經濟和環(huán)境友好等特點，在環(huán)境、食品、醫(yī)藥衛(wèi)生等領域得到了快速發(fā)展[10-14]。MSPD技術中，填料基質是關鍵，目前常用的有反相十八烷基鍵合硅膠、活性炭、樹脂等，發(fā)展新型功能基質是MSPD技術熱點研究領域[15]，同時，不同柱管型式影響分離效能是另一個考慮的重點[16]。山核桃Carya cathayensis為中國特產樹種[17-18]，也是浙江杭州地區(qū)特色食用品（主要分布在天目山區(qū)）。山核桃具有解毒、消腫之功效，臨床多用于腳痔、皮膚癬癥等[19]；山核桃葉中含有大量生物活性物質[20]，如酚類、植物甾醇、萜類、多糖、有機酸、蒽醌類、強心苷、三萜類化合物等，極具藥用價值。山核桃的食用、藥用價值與其品質密切相關，當前，人們密切關注山核桃中的污染物，尤其是重金屬離子含量對其品質的影響。由于山核桃具有硬實堅果的特點，其內含污染物通過經典分析較為繁瑣，尤其是樣品的前處理過程。人們試圖建立山核桃中污染物的快捷分析方法，其中樣品預處理技術及前期預示山核桃污染物方法是重要研究方向。目前，利用MSPD分離并檢測山核桃重金屬離子的研究尚未見文獻報道。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器、試劑與材料

原子吸收分光光度計（AA6800G，日本島津）；固相萃取小柱（中國上海月旭材料科技）。

石英砂、殼聚糖、草酸、氫氧化鈉、硝酸均為分析純（中國華東醫(yī)藥股份有限公司）；鈉基膨潤土（過0.076mm篩，購于中國浙江省臨安城北膨潤土有限公司）。山核桃葉及果實于8月初采集于臨安天目山。選取海拔50 m，同一水平上長勢、健康程度、所處環(huán)境等條件基本一致的優(yōu)質果樹作為樣本點，采用S形方式采樣，采集健康無病蟲害的樹葉及果實樣品。采集的山核桃葉及果實經蒸餾水、去離子水洗凈、干燥后，混勻放入研缽中并加入石英砂進行鮮樣研磨，過60目網篩后置于樣品瓶中備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 膨潤土改性 稱取1.0 g殼聚糖，攪拌條件下緩慢加入20.0 mL體積分數(shù)為10%草酸溶液，加熱至50℃，充分混勻，得到淡黃色黏滯性溶膠。加入30.0 mL去離子水稀釋，50℃攪拌30 min，緩慢加入8.0 g鈉基膨潤土，繼續(xù)攪拌2 h。加入適量1.0 mol·L-1氫氧化鈉（NaOH），攪拌1 h后用去離子水洗至中性，得到蓬松的絮狀顆粒膨潤土，抽濾微干后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 接續(xù)式基質固相萃取柱管設計與制作 接續(xù)式基質固相萃取柱為本實驗室專利產品（專利授權號：ZL 201020243703.4）。該設計萃取柱管可根據(jù)實際需要進行接續(xù)以增加柱效，也可通過調節(jié)柱徑及填料高度以增加柱效，既考慮了降低萃取劑消耗成本，又增加了裝柱填實的便捷性，提高了通用性。

1.2.3 標準溶液吸附、洗脫效果測試 40.0 mL 0.3 mol·L-1的標準鎳離子（Ni2+）和銅離子（Cu2+）組混合溶液，緩慢通過裝有新型吸附基質材料的吸附柱管，去離子水淋柱，收集流出液，定容至100.0 mL，測定金屬離子濃度（原子吸收分光光度法，AAS），計算吸附百分率。然后用40.0 mL 0.2 mol·L-1的硝酸（HNO3）溶液充分淋洗解吸，再用去離子水淋洗，收集全部流出液，定容至100.0 mL，測定金屬離子濃度（AAS），計算洗脫百分率。

1.2.4 山核桃葉中鎳離子（Ni2+）和銅離子（Cu2+）組的分離、富集 準確稱取1.0 g山核桃葉片放入研缽中，加入一定配比的新型吸附基質功能材料進行研磨，控制研磨時間為10 min，待混合基質研磨至細小顆粒狀時，進行干法裝柱，再以硝酸溶液進行洗脫提取，并對提取結果進行分析、檢測。本研究采用正交試驗確定新型MSPD提取重金屬離子組的最佳反應（單因素實驗結果此處不詳細列出）條件，影響因素考慮原料配比、洗脫劑濃度與洗脫劑用量，選定3因素3水平均勻設計進行實驗，L9（34）因素水平表見表1。

1.2.5 線性關系分析及鎳離子（Ni2+）和銅離子（Cu2+）組含量測定 準確稱取0.0393 g硫酸銅（CuSO4·5H2O），0.0495 g 硝酸鎳（NiNO3·6H2O）于 100.0 mL 容量瓶， 配置 100.0 mg·L-1的標準鎳離子（Ni2+）和銅離子（Cu2+）溶液，稀釋10倍配置成10.0 mg·L-1的標準重金屬離子溶液，分別量取0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL標準液于100.0 mL容量瓶中，定容，采用原子吸收分光光度計測定吸光度，繪制重金屬離子濃度—吸光度標準曲線。將1.2.4中新型基質固相萃取柱分離的洗脫液轉入100.0 mL容量瓶中，定容，按上述方法測定吸光度，并對含量進行計算分析，獲得新型基質固相萃取柱最佳工藝條件。

表1 正交因子水平表[L9（34）]Table1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.6 山核桃果實重金屬離子組殘留含量關聯(lián)分析 用1.2.5中得出的新型基質固相萃取柱最佳工藝條件按1.2.4節(jié)方法同樣處理山核桃果實，所得流出液定容后采用原子吸收分光光度計測定吸光度，計算鎳離子（Ni2+）和銅離子（Cu2+）組殘留含量，并進行山核桃葉與果實中重金屬離子的殘留關聯(lián)性分析。

1.2.7 新型基質固相萃取柱的實用可信度驗證 分別采用新型基質固相萃取柱和經典消解方法對鎳離子（Ni2+）和銅離子（Cu2+）重金屬離子組含量進行AAS吸光度測定，所得結果取平均值，以平均值簡潔比較方法進行統(tǒng)計對比，從而驗證新型基質固相萃取柱的實用性及可信度。

2 結果與討論

2.1 重金屬離子標準曲線制作及線性關系分析

配制成不同質量濃度的標準鎳離子（Ni2+）和銅離子（Cu2+）組溶液，測定吸光度，以質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線如圖1所示，所得線性回歸方程列于表2。

由圖1及表2可見：各標準曲線方程線性良好，可依據(jù)標準曲線方程線性計算鎳離子（Ni2+）和銅離子（Cu2+）組的質量濃度。

2.2 新型基質固相萃取柱吸附效率及洗脫效果測試

鎳離子（Ni2+）和銅離子（Cu2+）組標準混合溶液以定速過柱，硝酸溶液洗脫后收集流出液，采用AAS方法測定吸光度，換算得出重金屬離子的量，進而分別求出吸附效率及洗脫率，結果見表3。

圖1 鎳離子（Ni2+）和銅離子（Cu2+）溶液標準曲線Figure1 Standard curve of Ni2+and Cu2+heavy metal ions solution

表2 鎳離子（Ni2+）和銅離子（Cu2+）標準溶液線性回歸方程Table2 Linear regression equation of Ni2+and Cu2+standard solution

表3 新型基質固相萃取柱處理鎳離子（Ni2+）和銅離子（Cu2+）標準溶液吸附與洗脫率結果Table3 Absorption and elution rate of the new matrix solid-phase extraction column for Ni2+and Cu2+solution

由表3可見鎳離子（Ni2+）和銅離子（Cu2+）溶液經新型基質固相萃取柱提取、富集后吸附率均大于90%，經硝酸溶液洗脫，2種重金屬離子洗脫率也達到70%以上，由此可得新型吸附基質功能材料對于鎳離子（Ni2+），銅離子（Cu2+）等具有良好的吸附效果，洗脫也很方便，分離重金屬離子的可行性良好。

2.3 新型基質固相萃取柱提取重金屬離子的正交實驗結果

考慮原料配比、洗脫劑濃度與洗脫劑用量影響因素，將AAS測定新型基質固相萃取柱提取山核桃葉中重金屬離子的實際量作為指標，按1.2.4節(jié)進行3因素3水平正交試驗，結果如表4～5。

表4 鎳離子（Ni2+）實驗的 L9（34）正交表和分析結果Table4 L9（34） orthogonal table of Ni ion experiment and analysis results

從表4中可以看出：①k3＞k2＞k1；②k3＞k2＞k1；③k1＞k2＞k3。因此，山核桃葉片中重金屬鎳離子（Ni2+）提取、富集最佳工藝條件為A3B3C1，即原料配比=1∶5；洗脫劑濃度=0.4 mol·L-1；洗脫劑用量=30.0 mL。極差分析結果表明，3因素中影響順序為原料配比＞洗脫劑濃度＞洗脫劑用量。

從表5中可以看出：①k3＞k2＞k1；②k3＞k2＞k1；③k1＞k3＞k2。因此，山核桃葉中重金屬銅離子（Cu2+）提取、富集最佳工藝條件為A3B3C1，即原料配比=1∶5；洗脫劑濃度=0.4 mol·L-1；洗脫劑用量=30.0 mL。極差分析結果表明，3因素中影響順序為原料配比＞洗脫劑濃度＞洗脫劑用量。

2.4 山核桃果實重金屬離子組殘留含量關聯(lián)分析

采用新型基質固相萃取柱并選用最佳工藝條件處理山核桃果實，原子吸收分光光度計測定吸光度，計算鎳離子（Ni2+），銅離子（Cu2+）組殘留量。同時，進行山核桃葉片及果實中重金屬離子殘留關聯(lián)性分析，結果見表6及圖2。

表5 銅離子（Cu2+）實驗的L9（34）正交表和分析結果Table5 The L9（34） orthogonal table of Cu2+ion experiment and analysis results

表6 山核桃果實中重金屬鎳離子（Ni2+）和銅離子（Cu2+）的殘留含量及關聯(lián)性分析Table6 Residual content of Ni2+，Cu2+ions in the pecan fruit and the analysis of correlation

由圖2可知：山核桃果實中鎳離子（Ni2+）量占山核桃葉片中鎳離子（Ni2+）量的2.9%；山核桃果實中銅離子（Cu2+）的量占核桃葉片中銅離子（Cu2+）的量的3.7%；同時，分別將取自不同樣點山核桃葉片與果實的鎳離子（Ni2+），銅離子（Cu2+）殘留量做組相關分析，由表6方程可見：山核桃果實中鎳離子（Ni2+），銅離子（Cu2+）量與葉中鎳離子（Ni2+）， 銅離子（Cu2+）量的相關系數(shù) r分別為 0.8856和0.8453。由此可知：鎳離子（Ni2+），銅離子（Cu2+）可能隨著莖葉的傳導作用進入果實，在果實中逐漸積累，存在一定的殘留關聯(lián)性。

2.5 新型基質固相萃取柱實用、可信度驗證

采用經典方法對鎳離子（Ni2+）和銅離子（Cu2+）組進行吸光度測定，分別稱取0.3003，0.3006，0.3008 g葉子及0.3001，0.3004，0.3006 g果實進行平行實驗，樣本為小樣本，取平均值計算。同時，結合2.3節(jié)采用新型基質固相萃取柱最佳工藝條件測鎳離子（Ni2+）和銅離子（Cu2+）實驗結果，對比并驗證新型基質固相萃取柱分析重金屬離子的可信度，具體結果見表7。

圖2 山核桃葉及果實中重金屬離子組殘留量關聯(lián)分析Figure2 Relation analysis of residual content of heavy metal ion group in Carya cathayensis leaves and fruits

表7 經典方法和新型基質固相萃取柱分析方法所測重金屬離子對比Table7 Comparision with content of heavy metal ion between the classic method and MSPD method

由表7中數(shù)據(jù)比較分析可知：新型基質固相萃取柱所測得的葉片組和果實組中鎳離子（Ni2+）分別為經典方法所得的91.1%和77.8%；新型基質固相萃取柱所測得的葉片組和果實組中銅離子（Cu2+）分別為經典方法所得的89.1%和76.9%。與文獻報道固相萃取方法用于藥物分析、環(huán)境農藥殘留檢測等結果比較，效率較高[21-22]，說明新型基質固相萃取柱分析重金屬離子的可信度較好，可作為快速有效的測定模式。本工作制備的新型MSPD處理重金屬離子的機制可能是綜合作用機制（正相吸附、反相吸附、離子交換等），也可能包含新的作用機制，這是一個復雜且需要大量實驗驗證的工作，有待于后續(xù)開展深入的研究工作。

3 結論

本研究通過改性吸附基質功能材料碳18（C18）和活性炭等常規(guī)吸附基質，設計高效分離柱管，進而制備新型基質固相萃取柱。根據(jù)植物葉子成分與果實成分存在一定的量效關系原理，選取山核桃葉為前期指示物，通過新型基質固相萃取柱預處理制樣，考察新型基質固相萃取柱提取重金屬離子組的功效性能，進而開展對山核桃果實重金屬離子殘留關聯(lián)性研究，同時利用經典方法對新型基質固相萃取柱制樣及分析結果進行驗證，建立起區(qū)域特色產品-山核桃重金屬的新穎分析技術體系。從所得結果來看，本研究提出的前期指示物預測、監(jiān)控重金屬為一種有效方法，相關研究目前尚無報道。本研究所得結果在基質固相萃取技術與其他方法應用于林果等產品中重金屬離子殘留研究的分析比較前提下，可為基質固相萃取技術分析其他林果等食用產品中的重金屬離子殘留研究提供有益參考，對于更好地利用山核桃資源，也具有一定的現(xiàn)實意義。

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