袁榮發(fā) 余新 劉秀霞 王慶諾 蔡紅平 邵江華

1.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝膽外科，△江西省分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 江西 330006；2.南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院流行病學(xué)及統(tǒng)計(jì)學(xué)教研室，南昌 江西 33006

FAT10基因單體型與肝細(xì)胞癌的相關(guān)性研究

袁榮發(fā)1余新1劉秀霞△王慶諾1蔡紅平2邵江華1△

1.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝膽外科，△江西省分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 江西 330006；2.南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院流行病學(xué)及統(tǒng)計(jì)學(xué)教研室，南昌 江西 33006

背景與目的：人類白細(xì)胞抗原FAT10是類泛素調(diào)節(jié)子蛋白家族中的一員，被認(rèn)為與肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本研究探討FAT10基因單體型與肝細(xì)胞癌的關(guān)系。方法：收集254例肝癌病例和268例健康對照人群外周血標(biāo)本，提取DNA，通過DNA測序分析方法，檢測兩組人群FAT10基因外顯子和側(cè)翼序列單核苷酸多態(tài)性。應(yīng)用Haploview統(tǒng)計(jì)軟件分析研究對象的連鎖不平衡和單體型，并應(yīng)用病例對照分析方法進(jìn)行相關(guān)性研究。結(jié)果：在肝癌組和對照組FAT10基因外顯子和側(cè)翼序列上共檢測到10個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。遺傳不平衡發(fā)現(xiàn)-143 A/G、-121 A/G、+3446 C/T、+3476 T/C、+3527 T/C、+3607 T/C、+3620 C/G、+3803 C/G、+3809 G/T 9個(gè)SNPs在同一個(gè)單體型塊，其中-121 A/G、+3476 T/C、+3607 T/C、+3620 C/G和+3809 G/T多態(tài)位點(diǎn)完全連鎖。進(jìn)一步選擇-143 A/G、+3476 T/C和+3527T/C 3個(gè)tagSNPs進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析和單體型構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)-143 A/G和+3476 T/C基因型與相應(yīng)的野生型純合子相比能明顯降低肝癌發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)(P＜0.05)。進(jìn)一步單體型分析發(fā)現(xiàn)ATT、ATC、GCT和ACT 4種單體型，其中肝癌患者的GCT和ACT單體型頻率顯著低于對照組(P＜0.05)，而ATT單體型頻率顯著高于對照組(P＜0.05)，經(jīng)過1×108的隨機(jī)置換檢驗(yàn)校正后，ATT和GCT單體型與肝癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)仍然顯著相關(guān)。結(jié)論：FAT10基因單體型可能與肝癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，ATT單體型可能是肝癌的遺傳標(biāo)志。

肝細(xì)胞癌；單體型；病例對照研究；FAT10基因

泛素與泛素類似的小蛋白家族，被稱為泛素樣蛋白(ubiquitin-like proteins，UBLs)，且新成員不斷增加［1］。人類白細(xì)胞抗原FAT10屬于類泛素蛋白家族中的泛素樣修飾蛋白UBLs，是一個(gè)分子量為18×103、包含165個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，由兩個(gè)泛素樣結(jié)構(gòu)域融合而成。研究證實(shí)FAT10參與各種基本的細(xì)胞發(fā)展過程，包括免疫炎性介導(dǎo)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白易位和細(xì)胞周期調(diào)控等。另外，有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AT10在肝癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞和婦科癌細(xì)胞等患者中表達(dá)上調(diào)［3］，而且我們研究也發(fā)現(xiàn)降低FAT10基因的表達(dá)能明顯抑制Hep3B肝癌細(xì)胞生長，其主要停滯在G0/G1期，而S期和G2/M期細(xì)胞所占比例下降［4］。 這些表明FAT10在肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，但其單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotide polymorphism, SNP)和單體型在肝癌中的分布情況及與肝癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)分析未見報(bào)道。

單核苷酸多態(tài)性是在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的一種DNA序列多態(tài)性，是人類基因組中最常見的遺傳變異［5］。而位于一條染色體特定區(qū)域的一組相互關(guān)聯(lián)、并傾向于以整體遺傳給后代的SNP組合稱為單體型，決定基因的功能單位和人群遺傳變異的內(nèi)在特征［6］。單體型的存在可以極大地減少疾病關(guān)聯(lián)研究的工作量，以單個(gè)SNP為中心進(jìn)行復(fù)雜性狀疾病的易感基因研究常缺乏說服力，而利用相鄰的SNP信息關(guān)聯(lián)構(gòu)成的單體型分析則越來越受到歡迎。本研究運(yùn)用DNA測序的方法檢測FAT10基因外顯子和側(cè)翼序列SNPs位點(diǎn)的分布情況，并依據(jù)遺傳不平衡分析和納入標(biāo)準(zhǔn)選擇TagSNPs位點(diǎn)；隨后進(jìn)一步應(yīng)用Haploview統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單體型構(gòu) 建，同時(shí)采用單體型病例對照研究方法探討FAT10基因單體型與肝細(xì)胞癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)。

1 材料和方法

1.1 研究對象

254例肝癌患者和268例健康對照人群均為漢族。肝癌患者外周血標(biāo)本來自2007年1月—2010年12月南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝膽外科收治的經(jīng)手術(shù)后病理確診的病例；繼發(fā)性、復(fù)發(fā)性及接受非自體輸血患者除外；健康對照組為同期同地區(qū)健康體檢人群。病例組和對照組在性別、年齡、吸煙及飲酒上的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1)。

1.2 標(biāo)本采集及基因組DNA提取

經(jīng)患者的知情同意后， 抽取所有研究對象靜脈血5 mL置入裝有枸櫞酸鈉抗凝劑的試管中,采集后全血立即置-20 ℃保存。采用酚-氯仿抽提法提取全血細(xì)胞DNA。經(jīng)紫外分光光度計(jì)測定DNA濃度后將DNA樣品置-60 ℃儲(chǔ)存待檢。

1.3 FAT10基因SNPs檢測

FAT10基因各外顯子和側(cè)翼序列的多態(tài)性分析均采用DNA測序(DNA sequencing)方法，所有分型工作都是在不知道對象分組情況下進(jìn)行的，同時(shí)為了保證分型工作的正確性，以10%樣本量重復(fù)檢測。PCR體系為16 μL，包括2×Master Mix 8.75 μL，0.5 μmol/L引物 (FAT10基因第一外顯子和5’-非編碼區(qū)上游：5’-TAGACATAGAGATCTGCAGC-3’，下游：5’-TTCTCCTGAAGGATGCCTGC-3’；F A T 1 0基因部分第二外顯子上游：5’-TCCTAGGTAACTGTCTTGTG-3’，下游：5’-TCCATTGCAAGTCACAATC-3’；FAT10基因部分第二外顯子和3’-非編碼區(qū)上游：5’-CAGCTCAGTGGCACAAGT-3’，下游：5’-ACAAGGTATCAAGACAGA-3’)各1 μL，50 ng/μL DNA 模板1 μL，ddH2O 5.75 μL。采用Touchdown 程序在ABI 9700型擴(kuò)增儀上進(jìn)行，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后采用BigDye Terminator v3.1試劑盒(ABI公司，美國)進(jìn)行測序分型以確定SNP位點(diǎn)。

1.4 tagSNP位點(diǎn)的選擇

根據(jù)DNA測序數(shù)據(jù)和LD分析圖，本研究采用貪婪算法進(jìn)行系統(tǒng)打分來選擇位點(diǎn)，對一個(gè)特定的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)主要考慮了以下幾個(gè)因素：①多態(tài)性位點(diǎn)的次要等位基因頻率>5%；②Hardy-Weinberg 概率>0.001；③雜合子；④適用于基因分型平臺(tái)分析；⑤選擇能捕獲盡量多的SNPs。

1.5 連鎖不平衡和單體型分析

采用HaploView統(tǒng)計(jì)軟件(http://www.broad.mit.edu/haploview/haploview)及以D’和r2評(píng)估FAT10基因多態(tài)性位點(diǎn)之間的連鎖不平衡情況［7］，同時(shí)也進(jìn)行單體型頻率估計(jì)及關(guān)聯(lián)分析，其中頻率低于0.01的單體型除外。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。以χ2檢驗(yàn)比較性別、組間年齡、吸煙、飲酒、各基因型等分類變量在肝癌病例組與對照組之間分布的差異，采用χ2擬合優(yōu)度檢驗(yàn)明確各變異基因型在對照組分布是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。運(yùn)用非條件logistic回歸分析計(jì)算單體型OR值及其95%CI，采用 Haploview 統(tǒng)計(jì)軟件的隨機(jī)置換檢驗(yàn)程序校正實(shí)驗(yàn)結(jié)果，隨機(jī)置換檢驗(yàn)數(shù)值設(shè)置為10 000 000。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 研究對象的一般特征

患者組與對照組相比，兩組間在性別、年齡、吸煙、飲酒人數(shù)的分布和(或)構(gòu)成比上差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1)。其中年齡、性別為本研究的匹配因素，兩組研究對象的性別構(gòu)成基本一致(P>0.05)，年齡分布均衡。

表 1 肝癌組和對照組患者一般特征分布比較Tab. 1 General information of control group and HCC group patients[n(%)]

2.2 FAT10基因SNPs檢測結(jié)果

在H CC患者和正常對照人群中共檢測到10個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，即-143 A/G(rs362535)、- 121 A/G(r s2272991)、+ 3446 C/T、+3 476 T/C(rs2076484)、+3527 T/C(rs2076485)、+3607 T/C(rs2076486)、+3620 C/G(rs2076487)、+3803 C/G(rs8337)、+3809 G/T(rs7757931)和+3833 G/C(rs444013)，其中+3446 C/T SNP為新的位點(diǎn)(圖1)。

-143 A/G和-121 A/G位于5’非編碼區(qū)。+3446 C/T、+3476 T/C、+3527 T/C、+ 3607 T/C、+3620 C/G、+3803 C/G和+3809 G/T位于第二外顯子，+3833 G/C位于3’的非編碼區(qū)(圖2)。

2.3 FAT10基因的連鎖不平衡分析

運(yùn)用Ha ploview統(tǒng)計(jì)進(jìn)行連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)-143 A/G、-121 A/G、+3446 C/T、+3476 T/C、+3527 T/C、+3607 T/C、+3620 C/G、+3803 C/G和+3809 G/T 9個(gè)SNPs處于同一單體型塊中，其中-121 A/G、+3476 T/C、+3607 T/C、+3620 C/G和+3809 G/T多態(tài)位點(diǎn)完全連鎖。

2.4 FAT10基因tagSNPs位點(diǎn)的選擇

根據(jù)遺傳不平衡分析和TagSNP的納入標(biāo)準(zhǔn)，-143 A/G、+3476 T/C和+3527 T/C 3個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)選入本研究。+3476 T/C tagSNP 能tag 其他4個(gè)SNPs(-121 A/G、+3476 T/C、+3607 T/C、+3620 C/G和+3809 G/T多態(tài)位點(diǎn)完全連鎖)；+3446 C/T、+3803 C/G和+3833 G/C多態(tài)性位點(diǎn)被排除(+3446 C/T和+3803 C/G多態(tài)性位點(diǎn)次要等位基因頻率<5%，+3833 G/C多態(tài)性位點(diǎn)Hardy-Weinberg平衡定理概率P<0.001，表2)。選取的3個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的基因型分布在病例組和對照組均符合Hardy-Weinberg平衡定律。

表 2 病例組和對照組FAT10基因SNPs 一般信息Tab. 2 List of the information of the detected SNPs and the minor allele frequencies of the FAT10 gene among the study subjects

2.5 FAT10 基 因TagSNPs基因型、等位基因與肝細(xì)胞癌風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性

肝癌患者和健康對照組FAT10基因TagSNPs的基因型及等位基因分布頻率見表3。-143 A/G和+3476 T/C多態(tài)位點(diǎn)能降低肝癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(P<0.05)。

2.6 單體型分析

肝癌患者組和對照組FAT10基因的單體型分布頻率見表4，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ATT、ATC、GCT和ACT共4種單體型，其中肝癌患者的GCT和ACT單體型頻率顯著低于對照組(P<0.05)，而ATT單體型頻率顯著高于對照組(P<0.05)，經(jīng)過1×108的隨機(jī)置換檢驗(yàn)校正后，ATT和GCT單體型與肝癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)仍然顯著相關(guān)(P<0.05)。

表 3 病例組和對照組FAT10基因SNPs基因型、等位基因的分布情況Tab. 3 Frequency of FAT10 TagSNPs alleles and genotypes among patients and controls and the associations with the risk of HCC[n(%)]

表 4 病例組和對照組FAT10基因單體型分布情況Tab. 4 Frequencies of the haplotypes of the FAT10 gene in the HCC patients and controls and the associations with the risk of HCC n(%)

3 討 論

有研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸良性腫瘤、癌前病變及惡性腫瘤中，F(xiàn)AT10基因表達(dá)逐漸增加［8］。表明FAT10可能參與結(jié)直腸腫瘤的惡變。Allon等［9］發(fā)現(xiàn)在FAT10基因敲除小鼠中FAT10缺陷能促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡。FAT10的表達(dá)水平也被發(fā)現(xiàn)同p53突變、淋巴轉(zhuǎn)移和TNM分級(jí)有關(guān)［10］。本研究的前期研究也證實(shí)，F(xiàn)AT10基因在肝癌細(xì)胞中發(fā)揮重要功能［4］，這些充分說明FAT1 0與肝癌等惡性腫瘤關(guān)系密切，但其具體遺傳學(xué)作用機(jī)制尚不清楚。

本研究運(yùn)用DNA直接測序方法檢測522例(包括254例肝癌患者和268例正常對照組)中國漢族人群的FAT10基因外顯子和側(cè)翼序列的SNPs位點(diǎn)分布情況，同時(shí)利用Haploview軟件構(gòu)建肝癌患者和對照人群FAT10基因的單體型并進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析。我們發(fā)現(xiàn)在肝癌患者和對照人群中FAT10基因外顯子和側(cè)翼序列存在10個(gè)SNPs：143 A/G(rs362535)、-121 A/G(rs2272991)、+3446 C/T、+3476 T/C(rs2076484)、+3527 T/C(rs2076485)、+3607 T/C(rs2076486)、+3620 C/G(rs2076487)、+3803 C/G(rs8337)、+3809 G/T(rs7757931)和+3833 G/C(rs444013)，其中+3446 C/T是新的SNP。隨后我們進(jìn)行遺傳不平衡分析發(fā)現(xiàn)-143 A/G、-121 A/G、+3446 C/T、+3476 T/C、+3527 T/C、+3607 T/C、+3620 C/G、+3803 C/G和+3809 G/T 9個(gè)SNPs位于同一個(gè)單體型塊，其中-121 A/G、+3476 T/C、+3607 T/C、+3620 C/G和+3809 G/T

*多態(tài)位點(diǎn)完全連鎖(D’=1)。根據(jù)LD分析和tagSNP選擇標(biāo)準(zhǔn)本研究選擇-143 A/G、+3476 T/C和+3527T/C 3個(gè)tagSNPs進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析-143 A/G和+3476 T/C基因型與相應(yīng)的野生型純合子相比能明顯降低肝癌發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)(P<0.05)。進(jìn)一步單體型分析發(fā)現(xiàn)ATT、ATC、GCT和ACT共4種單體型，其中肝癌患者的GCT和ACT單體型頻率顯著低于對照組(P<0.05)，而ATT單體型頻率顯著高于對照組(P<0.05)，經(jīng)過1×108的隨機(jī)置換檢驗(yàn)校正后，ATT和GCT單體型與肝癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)仍然顯著相關(guān)。上述研究表明，F(xiàn)AT10基因該單體型遺傳區(qū)域可能在調(diào)節(jié)肝癌的易感性方面起重要作用。根據(jù)Gabrial等［11］的建議：侯選基因的單體型一般應(yīng)小于1 SNP/5 kb且實(shí)際間距趨于均勻方適于單體型分析。本研究構(gòu)建的FAT10的單體型符合上述原則能夠代表FAT10基因的功能單位，可用于FAT10基因的功能研究。

綜上所述，F(xiàn)AT10基因單體型可能與肝癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，ATT單體型可能是肝癌的遺傳標(biāo)志。由于本研究為小樣本非隨機(jī)抽樣，因此應(yīng)在大樣本和不同種族群體中進(jìn)一步研究。并且需要獲得更多的研究結(jié)果來進(jìn)一步闡明FAT10基因單體型產(chǎn)生效應(yīng)的具體分子機(jī)制，這將為肝癌的疾病的診斷、個(gè)體化治療及判斷預(yù)后提供新的方法。

［1］SCHULMAN B A. Twists and turns in ubiquitin-like protein conjugation cascades ［J］. Protein Sci, 2011, 20(12): 1941-1954.

［2］AICHEM A, GROETTRUP M. Detection and analysis of FAT10 modification ［J］. Methods Mol Biol, 2012, 832:125-132.

［3］LEE C G, REN J, CHEONG I S, et al. Expression of the FAT10 gene is highly upregulated in hepatocellular carcinoma and other gastrointestinal and gynecological cancers［J］.Oncogene, 2003, 22(17): 2592-2603.

［4］劉天德, 余新, 洪波, 等. siRNA對肝癌細(xì)胞異常表達(dá)FAT10基因的抑制效應(yīng)研究［J］. 新醫(yī)學(xué), 2009, 40(6): 358-360.

［5］STONEKING M, KRAUSE J. Learning about human population history from ancient and modern genomes［J］.Nat Rev Genet, 2011, 12(9): 603-614.

［6］BROWNING S R, BROWNING B L. Haplotype phasing:existing methods and new developments［J］. Nat Rev Genet,2011, 12(10): 703-714.

［7］BARRETT J C, FRY B, MALLER J, et al. Haploview:analysis and visualization of LD and haplotype maps［J］.Bioinformatics, 2005, 21: 263-265.

［8］QING X, FRENCH B A, OLIVA J, et al. Increased expression of FAT10 in colon benign, premalignant and malignant epithelial neoplasms［J］. Exp Mol Pathol, 2011, 90(1): 51-54.

［9］CANAAN A, YU X F, BOOTH C J, et al. FAT10/diubiquitinlike protein-deficient mice exhibit minimal phenotypic differences［J］. Mol Cell Biol, 2006, 26(13): 5180-5189.

［10］JI F, JIN X, JIAO C H, et al. FAT10 level in human gastric cancer and its relation with mutant p53 level, lymph node metastasis and TNM staging［J］. World J Gastroenterol,2009, 15(18): 2228-2233.

［11］GABRIEL S B, SCHAFFNER S F, NGUYEN H, et al. The structure of haplotype blocks in the human genome［J］.Science, 2002, 296(5576): 22.

Association on the haplotypes of FAT10 gene and hepatocellular carcinoma

YUAN Rong-fa, YU Xin,LIU Xiu-xia, WANG Qing-nuo, CAI Hong-ping, SHAO Jiang-hua(Department of Hepatobiliary Surgery, The Second Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang Jiangxi 330006, China)

SHAO Jiang-hua E-mail：shao5022@163.com

Background and purpose：The human HLA-FAT10 gene is a member of the ubiquitin-likemodifier family of proteins, are thought to be associated with the development and progression of hepatocellular carcinoma (HCC). This study aimed to assess the association between FAT10 gene haplotypes and hepatocellular carcinoma.Methods：Two hundred and sixty-eight healthy persons as control and 254 patients with HCC were recruited. Genotyping was done by using DNA sequencing. Haplotypes were determined through genotypic and disequilibrium analysis using identified single nucleotide polymorphisms (SNPs).Results：Ten SNPs in FAT10 exonic and fl anking sequence were identified, and -143 A/G, -121 A/G, +3446 C/T, +3476 T/C, +3527 T/C, +3607 T/C, +3620 C/G, +3803 C/G, +3809 G/T polymorphisms clustered in a block, the complete linkage disequilibrium(D’=1) was also detected among -121 A/G, +3476 T/C, +3607 T/C, +3620 C/G, +3809 G/T. Further more, the -143 A/G, +3476 T/C, +3527T/C SNPs were enrolled in the association analysis and haplotype analysis. The -143 A/G, +3476 T/C genotypes were associated with a decreased risk for HCC (P＜0.05). A total of 4 haplotypes were found, namely ATT, ATC, GCT, ACT, the frequency of GCT and ACT haplotypes were significantly lower for HCC patients than for control subjects(P＜0.05), and the frequency of ATT was significantly higher for HCC patients than for control subjects(P＜0.05). Ten million permutation testing also indicated that the ATT and GCT haplotypes were associated with HCC susceptibility.Conclusion：The haplotypes of FTA10 gene may be involved in the susceptibility of HCC, the ATT might serve as genetic marker for HCC.

Hepatocellular carcinoma; Haplotype; Case-control studies; FAT10 gene

10.3969/j.issn.1007-3969.2012.05.006

R735.7

A

1007-3639(2012)05-0352-06

江西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No：2008GZY0059)。

邵江華 E-mail:shao5022@163.com

2011-12-16

2012-03-13）