王輝 牛國梁 張樹友 謝榮俊 梁娜

1. 南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院普外科，湖南 衡陽 421002；2. 合肥市第二人民醫(yī)院普外科，安徽 合肥 230041

姜黃素對人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞裸鼠移植瘤放射增敏的作用

王輝1,2牛國梁1張樹友1謝榮俊1梁娜1

1. 南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院普外科，湖南 衡陽 421002；2. 合肥市第二人民醫(yī)院普外科，安徽 合肥 230041

背景與目的：姜黃素(curcumin)能有效增強(qiáng)放射線對腫瘤的作用，但其作用機(jī)制尚不清楚。該研究旨在探討姜黃素是否對人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞裸鼠移植瘤有放射增敏效應(yīng)，并探討其協(xié)同抑制效應(yīng)的機(jī)制。方法：人乳腺癌裸鼠移植瘤模型建立成功后，將裸鼠隨機(jī)分為4組：對照組、藥物組、放射組和聯(lián)合組(姜黃素+放射)，每組6只；檢測裸鼠移植瘤的體積及體質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率，并繪制移植瘤的生長曲線；免疫組織化學(xué)法檢測血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表達(dá)；蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)及缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)的蛋白表達(dá)。結(jié)果：聯(lián)合組的抑瘤率［(71.62±6.11)%］顯著高于放射組［(41.76±5.84)%］(P＜0.05)。免疫組化結(jié)果顯示，單純放射不能使VEGF表達(dá)下調(diào)(P＞0.05)，姜黃素聯(lián)合放射能明顯抑制VEGF的表達(dá)(P＜0.01)。Western blot結(jié)果顯示，姜黃素與放射均可抑制MMP-9的表達(dá)，兩者聯(lián)用較單純放射效果更加顯著(P＜0.05)；單純放射不能抑制HIF-1α的表達(dá)(P＞0.05)，姜黃素聯(lián)合放射HIF-1α蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.01)。結(jié)論：姜黃素可以增強(qiáng)乳腺癌裸鼠移植瘤的放射敏感性，其機(jī)制可能是通過下調(diào)VEGF、MMP-9和HIF-1α的蛋白表達(dá)而發(fā)揮作用。

姜黃素；乳腺癌；血管內(nèi)皮生長因子；基質(zhì)金屬蛋白酶-9；缺氧誘導(dǎo)因子-1α

乳腺癌是嚴(yán)重威脅女性健康的惡性腫瘤之一，放療正成為乳腺癌特別是早期乳腺癌治療的重要手段，但在接受放療時(shí)可能出現(xiàn)放射抗拒、腫瘤復(fù)發(fā)、不良反應(yīng)增多等情況［1］。因此，尋找一種放射增敏劑是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。姜黃素是從姜黃中提取的一種多酚，具有高效低毒、胃腸道反應(yīng)較小的特點(diǎn)。近來研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素不僅具備抗腫瘤作用，還可以增強(qiáng)放射敏感性［2-4］，但其具體機(jī)制尚不清楚。為此，本實(shí)驗(yàn)研究姜黃素對人乳腺癌MDAMB-231細(xì)胞裸鼠移植瘤放射敏感性的影響，探討其放射增敏的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株購自中科院上海生物研究所；BALB/c裸鼠(雌性，4~5周齡，體質(zhì)量18~22 g)，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司；免疫組化試劑盒及蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)試劑盒購自北京中杉金橋生物有限公司，姜黃素購自Sigma公司，用二甲基亞砜(DMSO)配成儲存液，于-20 ℃下保存，使用前用無菌的0.9%NaCl溶液稀釋至所需濃度。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及裸鼠模型的制備

人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)液為RPMI-1640，其中含10%小牛血清和1×105U/L青霉素及鏈霉素。將培養(yǎng)的MDA-MB-231細(xì)胞配成單細(xì)胞懸液，每只裸鼠背部皮下按0.2 mL接種，每只裸鼠平均接種6×106個(gè)細(xì)胞，共24只。移植瘤長至直徑為5 mm時(shí)認(rèn)為接種成功，給藥之前將裸鼠隨機(jī)分成對照組、藥物組、放射組和聯(lián)合組(姜黃素+放射)共4組。

1.3 動物給藥及放射線照射

待腫瘤體積為120 mm3時(shí)，對照組給予0.9%NaCl溶液0.2 mL/d灌胃，藥物組給予姜黃素15 mg/(kg·d)灌胃，放射組給予一次性20 Gy射線照射，聯(lián)合組給予姜黃素15 mg/(kg·d)和一次性20 Gy射線照射。照射采用10 mV的電子線，劑量率為250 cGy/min，裸鼠背部置于放射野中，其余身體部分用鉛板阻隔，SSD為96 cm。照射完畢后繼續(xù)飼養(yǎng)，連續(xù)觀察30 d后斷頸法處死裸鼠稱取瘤重，計(jì)算抑瘤率，腫瘤體積=(長徑×短徑2)/2，抑瘤率=(對照組移植瘤體積-實(shí)驗(yàn)組移植瘤體積)/對照組移植瘤體積×100%。

1.4 免疫組織化學(xué)檢測血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表達(dá)

切片常規(guī)脫蠟水化后，3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性；組織抗原修復(fù)，動物血清封閉，滴加VEGF一抗，工作液濃度為1∶100(產(chǎn)品為北京中杉金橋生物有限公司)，4 ℃溫育過夜，二抗溫育后鏈霉素抗生物素蛋白工作液溫育，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，依次脫水、透明、固定。以PBS代替一抗作為對照物，在細(xì)胞核、細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)中呈現(xiàn)棕黃色為陽性。圖像分析：在20倍物鏡下，隨機(jī)測量100個(gè)陽性細(xì)胞的平均灰度值(背景灰度值-實(shí)測灰度值)，顏色越深，灰度值越小。

1.5 Western blot檢測基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)及缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)蛋白的表達(dá)

取少量標(biāo)本置于研缽中，裂解液充分裂解提取蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量，取40 μg蛋白SDS-PAGE凝膠電泳，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，封閉震蕩1 h，分別加入稀釋濃度為1∶500的MMP-9及HIF-1α一抗(購自北京中杉金橋生物有限公司)，以β-actin為內(nèi)參，37 ℃溫育1 h，洗膜后加入再分別相應(yīng)二抗，工作液濃度為1∶1 000，37 ℃溫育1 h。暗室中用ECL發(fā)光法顯色，曝光，定影，水洗，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。膠片用掃描儀進(jìn)行灰度掃描，Alpha Imager 2200軟件分析各組標(biāo)本灰度值(V值)，并將V值與對應(yīng)標(biāo)本的Vβ-actin相比，計(jì)算出樣本蛋白相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)采用表示。4組樣本均數(shù)比較采用方差分析中S-N-K法(Students-Newman-Keuls)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 裸鼠移植瘤重量及體積變化

對照組、藥物組、放射組及聯(lián)合組的瘤重分別為(1.802±0.298)g、(1.378±0.267)g、(1.108±0.232)g和(0.598±0.211)g，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各組移植瘤的體積隨時(shí)間均呈增大變化(表1、圖1)，對照組的增長幅度最大，聯(lián)合組增長幅度最小。以對照組為參照，藥物組、放射組及聯(lián)合組抑瘤率分別為(32.84±3.49)%、(41.76±5.84)%和(71.62±6.11)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 免疫組化檢測VEGF表達(dá)情況

免疫組化結(jié)果(表2、 圖2)顯示，與對照組比較，單純放射不能使VEGF表達(dá)下調(diào)(q=0.733，P=0.474)，姜黃素可以明顯抑制VEGF的表達(dá)(q=4.390，P<0.01)，而姜黃素聯(lián)合放射抑制VEGF表達(dá)更加顯著(q=14.929，P<0.01)。

表 2 免疫組化檢測各組移植瘤中VEGF蛋白表達(dá)情況Tab. 2 The expression of VEGF protein by immunohistochemistry in each group

2.2 Western blot檢測MMP-9及HIF-1α蛋白的表達(dá)情況

表 1 各組移植瘤體積隨時(shí)間變化情況Tab. 1 The changes of xenograft’ size with time in each group(mm3)

以β-actin為內(nèi)參照，Western blot檢測結(jié)果(表3、圖3)顯示，姜黃素與放射均能抑制MMP-9的表達(dá)，兩者聯(lián)用較單純放射效果更加顯著(P<0.05)。與對照組相比，單純放射不能使HIF-1α蛋白表達(dá)下降(q=0.977，P>0.05)；而相對于藥物組和放射組，姜黃素聯(lián)合放射后HIF-1α蛋白表達(dá)降低(q=9.938，P<0.01；q=18.573，P<0.01)。

表 3 Western blot檢測各組移植瘤中MMP-9和HIF-1α蛋白表達(dá)的半定量統(tǒng)計(jì)Tab. 3 The expression of MMP-9 and HIF-1α protein by Western blot in each group

3 討 論

VEGF是已知活性最強(qiáng)的促血管生成因子［5］，與bFGF、內(nèi)皮素-1、TGF-β等多種促血管因子誘導(dǎo)腫瘤毛細(xì)血管生成和血液循環(huán)的建立。研究發(fā)現(xiàn)，VEGF不僅參與腫瘤的發(fā)生與侵襲，而且與放射抵抗密切相關(guān)，由此影響腫瘤放射治療的敏感性［6-7］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，單純放射不能抑制VEGF的表達(dá)，姜黃素聯(lián)合放射后VEGF表達(dá)下調(diào)，提示單純射線的電離作用誘導(dǎo)VEGF的高表達(dá)，降低了放射敏感性，而姜黃素通過阻斷血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異活性，抑制其分裂增殖，使VEGF表達(dá)下調(diào)，從而起到了放射增敏效應(yīng)及其抗癌作用［8］。

MMP-9是依賴金屬鋅離子蛋白水解酶成員之一，參與降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)等病理生理過程，并在多數(shù)腫瘤中呈高表達(dá)。本研究中，姜黃素與放射均可抑制MMP-9的表達(dá)，兩者聯(lián)合抑制效應(yīng)大于單用姜黃素和放射之和，證實(shí)姜黃素具有增強(qiáng)放射線敏感性的作用，這與Kunnumakkara等［9］研究發(fā)現(xiàn)姜黃素聯(lián)合放射明顯抑制人結(jié)腸癌裸鼠移植瘤中MMP-9的表達(dá)相一致，推測其增敏的機(jī)制可能是通過減少M(fèi)MP-9的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而起到了放射增敏的效果。HIF-1是乏氧細(xì)胞調(diào)節(jié)其生長微環(huán)境的一種內(nèi)源性因子，由HIF-lα和HIF-lβ兩個(gè)亞單位組成。增長迅速的腫瘤細(xì)胞容易產(chǎn)生乏氧細(xì)胞，后者導(dǎo)致機(jī)體微循環(huán)障礙，影響放射線對腫瘤細(xì)胞的殺傷效果。本研究結(jié)果顯示，單純放射不能抑制HIF-1α的表達(dá)，聯(lián)用姜黃素后HIF-1α表達(dá)明顯下調(diào)，表明腫瘤細(xì)胞對單純放射存在抗拒性可能與腫瘤內(nèi)乏氧細(xì)胞有關(guān)，而姜黃素可能緩沖了射線產(chǎn)生乏氧細(xì)胞的數(shù)量，增強(qiáng)了放射的敏感性［10-11］。因此，通過阻斷HIF-1α的途徑，可能是姜黃素在乳腺癌放射增敏中的又一機(jī)制。

本研究證實(shí)了姜黃素對乳腺癌裸鼠移植瘤有放射增敏作用，MMP-9介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)的降解與腫瘤血管生成密切相關(guān)；而HIF-1α誘導(dǎo)的乏氧細(xì)胞，導(dǎo)致腫瘤局部血供障礙，腫瘤組織中VEGF、MMP-9和HIF-1α三者彼此相互影響，嚴(yán)重影響了放射效果。實(shí)驗(yàn)中我們還發(fā)現(xiàn)，單純放射可以抑制移植瘤的重量和體積，卻不能抑制腫瘤內(nèi)VEGF和HIF-1α的表達(dá)，其原因?yàn)槟[瘤形成是一個(gè)復(fù)雜的過程，有多種因素及機(jī)制參與，同時(shí)還存在與其他信號通路的“交叉對話”。具體機(jī)制及其他信號通路需要進(jìn)一步探討和研究，期待能為乳腺癌綜合治療尋找新的方向。

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Effect of curcumin on radiosensitization on xenograft tumor of breast cancer of MDA-MB-231 cells in nude mice

WANG Hui, NIU Guo-liang, ZHANG Shu-you, XIE Rong-jun, LIANG Na(Department of General Surgery, the Affiliated Nanhua Hospital, University of South China, Hengyang Hunan 421002, China)

ZHANG Shu-you E-mail：zshuyou2@126.com

Background and purpose：Curcumin can enhance the radiation sensitivity on tumor effectively,but the mechanism of radiosensitization is still unclear. The present study aimed to investigate whether curcumin could enhance the radiation sensitivity on xenograft tumor of breast cancer of MDA-MB-231 cells in nude mice, and to investigate the underlying mechanism.Methods：Human breast cancer xenograft model on nude mice was established successfully, and the mice were divided into 4 groups: control group, curcumin group, radiation group, combination group (radiation+curcumin) (6 mice each group). The size and weight of xenograft tumor were detected, the tumor inhibition rate was calculated and the xenograft tumor growth curve was depicted. Immunohistochemistry was adopted to detect the expression of VEGF. Western blot was used to detect the expression of MMP-9 and HIF-1α.Results：The tumor inhibition rate in the combination group [(71.62±6.11)%] was significantly higher than that in the radiation group [(41.76±5.84)%](P＜0.05). The result by immunohistochemistry showed that radiation therapy could not inhibit the expression of VEGF (P=0.05), while curcumin and radiation combination inhibited the expression of VEGF(P＜0.01). The result of Western blot showed that curcumin or radiation inhibited the expression of MMP-9, curcumin and radiation combination inhibited the expression of MMP-9 more significantly (P＜0.05). Radiation could not inhibit the expression of HIF-1α (P＞0.05), curcumin and radiation combination inhibited the expression of VEGF significantly(P＜0.01).Conclusion：Curcumin can enhance the radiosensitivity in nude mice xenografts of breast cancer, and the mechanism involves the down-regulation of VEGF, MMP-9 and HIF-1α.

Curcumin; Breast cancer; VEGF; MMP-9; HIF-1α

10.3969/j.issn.1007-3969.2012.05.004

R73-36+1；R737.9

A

1007-3639(2012)05-0342-05

湖南省中醫(yī)藥科研計(jì)劃項(xiàng)目(NO：2010087)。

張樹友 E-mail:zshuyou2@126.com

2011-12-09

2012-03-14）