袁芳 鞠吉雨 唐媛媛 邸大琳 王麗娜 孫萍

1. 濰坊醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，山東 濰坊 261053；2. 青州市疾病預(yù)防控制中心，山東 青州 262500

BCSC-1基因異位表達(dá)對(duì)人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)

袁芳1,2鞠吉雨1唐媛媛1邸大琳1王麗娜1孫萍1

1. 濰坊醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，山東 濰坊 261053；2. 青州市疾病預(yù)防控制中心，山東 青州 262500

背景與目的：人乳腺癌候選抑制蛋白1(breast cancer suppressor candidate 1，BCSC-1)基因已被證實(shí)是一種新型抑癌基因，在多種腫瘤細(xì)胞均存在表達(dá)缺失的現(xiàn)象。該研究通過將BCSC-1基因轉(zhuǎn)染至人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H446，探討B(tài)CSC-1基因異位表達(dá)對(duì)NCI-H446細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)。方法：用PCR擴(kuò)增BCSC-1 cDNA，構(gòu)建真核重組表達(dá)載體pcDNA3.1/v5-HisB-BCSC-1。通過脂質(zhì)體把pcDNA3.1/v5-HisB-BCSC-1和空質(zhì)粒pcDNA3.1/v5-HisB轉(zhuǎn)染入野生型NCI-H446細(xì)胞。以轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.1/v5-HisB的NCI-H446細(xì)胞為對(duì)照組，野生型NCI-H446細(xì)胞為空白對(duì)照組。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期；MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖；免疫組化確認(rèn)BCSC-1基因和CD44分子在NCI-H446細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果：成功構(gòu)建了真核重組表達(dá)載體pcDNA3.1/v5-HisB-BCSC-1，制備了BCSC-1基因異位高表達(dá)的NCI-H446穩(wěn)定細(xì)胞株。細(xì)胞周期分析顯示，異位表達(dá)BCSC-1的NCI-H446細(xì)胞大部分阻滯在G0/G1期，明顯高于對(duì)照組和空白組(P＜0.01)。MTT法檢測(cè)顯示，異位表達(dá)BCSC-1的NCI-H446細(xì)胞與對(duì)照組、空白組相比，生長(zhǎng)速度明顯減慢(P＜0.05)。免疫組化顯示異位表達(dá)BCSC-1的NCI-H446細(xì)胞CD44表達(dá)增高。結(jié)論：BCSC-1基因的異位表達(dá)對(duì)NCI-H446細(xì)胞的惡性增殖行為有明顯的抑制作用，這種抑制作用可能與細(xì)胞周期阻滯和黏附分子CD44表達(dá)增高有關(guān)。

BCSC-1基因；NCI-H446細(xì)胞；生長(zhǎng)曲線；細(xì)胞周期；CD44

腫瘤的惡性生物學(xué)行為受眾多基因調(diào)控［1-2］?，F(xiàn)已證實(shí)，很多腫瘤的發(fā)生與抑癌基因的表達(dá)缺失有關(guān)。給瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)入抑癌基因可以達(dá)到治療腫瘤的目的。人乳腺癌候選抑制蛋白1(breast cancer suppressor candidate 1，BCSC-1)基因位于人類染色體11q23-q24，現(xiàn)已證實(shí)在多種實(shí)體瘤細(xì)胞中，如乳腺癌、肺癌、卵巢癌等染色體的該區(qū)域常缺失［3］。把正常人染色體11q導(dǎo)入乳腺癌、肺癌、宮頸癌或卵巢癌細(xì)胞，一定程度上可以抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和裸鼠體內(nèi)的成瘤性生長(zhǎng)［4-5］。Martin等［3］在41株腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)33株(80%)BCSC-1 mRNA表達(dá)明顯缺失，他們將克隆的BCSC-1 cDNA轉(zhuǎn)染入人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H460后，H460細(xì)胞在接種裸鼠體內(nèi)的成瘤性生長(zhǎng)減弱。因此，Martin等［3］提出BCSC-1基因是候選抑癌基因。本研究克隆了BCSC-1 cDNA，將其轉(zhuǎn)入NCI-H446細(xì)胞，探討B(tài)CSC-1基因異位表達(dá)對(duì)人小細(xì)胞肺癌NCI-H446細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株、質(zhì)粒與主要試劑

原核表達(dá)載體pDC316-BCSC-1和真核表達(dá)載體pcDNA3.1/v5-HisB、大腸桿菌DH5α、NCI-H446細(xì)胞均由本室保存；BCSC-1單克隆抗體為本實(shí)驗(yàn)室制備［6］。CD44抗體和SP組化試劑盒購自北京博奧森公司；T4DNA連接酶、限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ/XbaⅠ購自TaKaRa公司；Taq DNA聚合酶、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購自上海生工公司；DNA Marker和蛋白Marker均購自北京Tiangen公司；Lipotap脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 PCR擴(kuò)增目的片段BCSC-1 cDNA

根據(jù)BCSC-1基因序列(GenBank Accession Number：NM_014622 )，利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)一對(duì)引物擴(kuò)增人BCSC-1基因編碼序列全長(zhǎng)：上游引物P1為5’-GTGGAATTCTATGGTGCACTTCTGTGGCCT A C-3’，引入E c oRⅠ酶切位點(diǎn)，下游引物P2為5’-ATTCTCGAGCGAAAGGCAAAGATAGCATCC-3’，引入XbaⅠ酶切位點(diǎn)，引物由上海生工生物公司合成。以pDC316-BCSC-1為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min。94 ℃45 s，55℃ 30 s，72 ℃ 3 min，共25個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，用1.0%瓊脂糖電泳分析PCR結(jié)果，用凝膠回收試劑盒回收，并用乙醇沉淀法純化目的片段。

1.3 真核重組載體pcDNA3.1/v5-HisB-BCSC-1的構(gòu)建

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、質(zhì)粒pcDNA3.1/v5-HisB用EcoRⅠ/XbaⅠ雙酶切。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pcDNA3.1/v5-HisB在T4連接酶作用下連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，將菌液涂布于含50 mg/L氨芐青霉素的LB平板，篩選陽性克隆，抽提質(zhì)粒，并進(jìn)一步用PCR和酶切初步鑒定后送上海生工測(cè)序鑒定。測(cè)序正確的命名為pcDNA3.1/v5- HisB-BCSC-1。

1.4 NCI-H446細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前一天將野生型NCI-H446(W細(xì)胞)轉(zhuǎn)至6孔培養(yǎng)板(Corning-Costar)中，使細(xì)胞第2天能長(zhǎng)到70%～80%，此時(shí)按Lipotap脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說明書將質(zhì)粒pcDNA3.1/v5-HisB-BCSC-1和對(duì)照空質(zhì)粒pcDNA3.1/v5-HisB分別轉(zhuǎn)染入NCI-H446細(xì)胞。以轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.1/v5-HisB的NCI-H446細(xì)胞為對(duì)照組，野生型NCI-H446細(xì)胞為空白組。在CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、37 ℃溫箱溫育48 h后，在培養(yǎng)基中加入終濃度為400 μg/mL的G418進(jìn)行篩選，待到第7天野生型細(xì)胞全部死亡，將轉(zhuǎn)染入空質(zhì)粒和帶有BCSC-1基因的細(xì)胞調(diào)整G418濃度為200 μg/mL，維持培養(yǎng)2周，得到G418抗性克隆，免疫組化法測(cè)定BCSC-1的表達(dá)。

1.5 四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

用胰酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以 5×103/mL的細(xì)胞密度接種于96孔板中，每孔200 μL，連續(xù)培養(yǎng)7 d，每隔24 h行MTT檢測(cè)。每孔加入MTT 20 μL(5 mg/mL)，37 ℃溫育4 h后，加入150 μL DMSO，震蕩15 min，酶標(biāo)儀上490 nm處測(cè)A值，每組細(xì)胞4個(gè)復(fù)孔取平均值。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期

取6孔板中對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，胰酶消化后，400目鋼網(wǎng)過濾，使細(xì)胞成單個(gè)細(xì)胞懸液。將待測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)入1.5 mL Eppendorf離心管。1 000 r/min離心(r=16 cm)，去上清液。PBS洗2次，加入1 mL 70%預(yù)冷的乙醇，4 ℃固定過夜。次日，將細(xì)胞1 000 r/min離心(r=16 cm)后PBS洗1次，去上清液。加入500 μL PBS，其中含50 μg/mL碘化丙啶(PI)、100 μg /mL RNase A和0.2% Triton X-100，4 ℃避光溫育30 min。上FACSort流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。

1.7 SP免疫組化檢測(cè)CD44和BCSC-1的表達(dá)

免疫組化檢測(cè)CD44和BCSC-1的表達(dá)［6］。按2×104/mL的細(xì)胞密度將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中進(jìn)行細(xì)胞爬片，5 d后進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色鑒定。PBS清洗細(xì)胞3次，4%多聚甲醛固定15 min，空氣干燥5 min，PBS清洗標(biāo)本 3次，加0.5% Triton X-100后溫育20 min，加3% H2O2去離子水溫育15 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性；每片滴加試劑封閉用正常山羊血清工作液100 μL，室溫溫育15 min，傾去；分別滴加BCSC-1抗體(1∶2 000)、CD44抗體(1∶400)，濕盒4 ℃過夜；PBS洗3次，滴加生物素化羊抗鼠IgG工作液，于37℃溫育30 min；PBS洗3次，加辣根酶標(biāo)記卵白素工作液于濕盒 37 ℃溫育15 min；PBS洗 3次；DAB顯色3 min，自來水沖洗，再用蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、封片。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，Student’s t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 BCSC-1基因的擴(kuò)增

以pDC316-BCSC-1為模板，擴(kuò)增人BCSC-1基因，其全長(zhǎng)為2 361 bp，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳可見清楚的特異擴(kuò)增帶，片段大小與預(yù)期結(jié)果相符(圖1)。

2.2 重組質(zhì)粒pcDNA3.1/v5-His B-BCSC-1的構(gòu)建

將PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒pcDNA3.1/v5-HisB進(jìn)行EcoRⅠ和XbaⅠ限制性酶切，純化后在T4連接酶作用下進(jìn)行連接。重組質(zhì)粒經(jīng)酶切及PCR鑒定，目的片段大小與預(yù)期相符(圖2)。經(jīng)上海生工公司DNA測(cè)序后結(jié)果顯示，目標(biāo)序列與GenBank (Accession Number：NM_014622)相應(yīng)序列相符，證實(shí)表達(dá)載體質(zhì)粒pcDNA3.1/v5-HisBBCSC-1構(gòu)建成功。

2.3 BCSC-1基因異位表達(dá)對(duì)NCI-H446細(xì)胞增殖能力的影響

細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示，異位表達(dá)BCSC-1的NCI-H446細(xì)胞與空載體轉(zhuǎn)染組和野生NCI-H446細(xì)胞相比，生長(zhǎng)明顯減慢。從實(shí)驗(yàn)第4天開始有差別，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)差別越來越明顯(P<0.05，圖3)。

2.4 BCSC-1基因異位表達(dá)對(duì)NCI-H446細(xì)胞周期的影響

異位表達(dá)BCSC-1的NCI-H446細(xì)胞、空載體組及野生型NCI-H446的細(xì)胞分別有(58.11±2.3)%、(52.79±2.4)%、(45.95±0.9)%細(xì)胞處于G0/G1期，分別有(27.23±1.3)%、(34.45±2.4)%、(38.55±0.6)%細(xì)胞處于S期，分別有(14.66±1.8)%、(12.75± 2.0)%、(15.50±1.2)%細(xì)胞處于G2期(圖4)。細(xì)胞周期分析顯示，野生型NCI-H446細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載體的NCI-H446細(xì)胞有較多細(xì)胞處于S期或G2/M期，而異位表達(dá)BCSC-1的NCI-H446細(xì)胞大部分阻滯在G0/G1期(P<0.01)。

2.5 BCSC-1基因異位表達(dá)對(duì)BCSC-1和CD44的影響

用抗BCSC-1和CD44抗體進(jìn)行免疫組化染色顯示，BCSC-1在野生型NCI-H446細(xì)胞中表達(dá)很低，異位表達(dá)的BCSC-1主要集中在細(xì)胞質(zhì)，在核周有聚集現(xiàn)象；與野生型NCI-H446細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的NCI-H446細(xì)胞相比，異位表達(dá)BCSC-1的NCI-H446細(xì)胞黏附分子CD44表達(dá)也增強(qiáng)(圖5，圖6)。

3 討 論

基因治療近年來已成為腫瘤研究的領(lǐng)域。鑒于抑癌基因在維持基因組完整性和調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡中起重要作用，抑癌基因缺失或突變所致的功能異常直接與腫瘤發(fā)生相關(guān)，使用抑癌基因置換成增補(bǔ)患者體內(nèi)有缺陷的基因是腫瘤基因治療的研究熱點(diǎn)之一［7-8］。

BCSC-1基因是近年發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，其異位表達(dá)可以抑制鼻咽癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，提示了在人鼻咽癌細(xì)胞CNE-2L2中BCSC-1是抑癌基因［9］。野生型CNE-2L2細(xì)胞的BCSC-1基因表達(dá)極低，因此BCSC-1基因在CNE-2L2細(xì)胞的異位表達(dá)可以抑制細(xì)胞惡性生物學(xué)行為。而BCSC-1基因的異位表達(dá)是否對(duì)所有(或大多數(shù))內(nèi)源性低表達(dá)此基因的腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為均有明顯的抑制作用？本研究將BCSC-1基因轉(zhuǎn)染入人小細(xì)胞肺癌NCI-H446細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BCSC-1基因的異位表達(dá)明顯抑制NCH-H446細(xì)胞的增殖，進(jìn)一步證實(shí)了BCSC-1基因是一個(gè)抑癌基因。

此外，本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)細(xì)胞周期的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染BCSC-1基因的細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯，而其他對(duì)照組細(xì)胞沒有發(fā)生。這表明BCSC-1基因能抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，至少有部分是由于G1期阻滯所致。免疫組化的結(jié)果顯示，異位表達(dá)BCSC-1的NCI-H446細(xì)胞黏附分子CD44的表達(dá)增高。CD44分子表達(dá)與肺癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和黏附有著密切關(guān)系，而CD44表達(dá)與肺癌轉(zhuǎn)移是否相關(guān)現(xiàn)有資料尚有爭(zhēng)論。一般認(rèn)為，CD44在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)，在小細(xì)胞肺癌中不表達(dá)；在高分化肺癌中的表達(dá)高于低分化肺癌［10］；Kazuhisa等［11］發(fā)現(xiàn)CD44的表達(dá)恢復(fù)有助于增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對(duì)巨噬細(xì)胞毒性的敏感性，但最近也有報(bào)道認(rèn)為CD44是小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞的標(biāo)志［12］。因此，BCSC-1異位表達(dá)對(duì)CD44表達(dá)增強(qiáng)的調(diào)控可能是影響細(xì)胞增殖的重要因素，但其機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。通過本研究，我們可以初步認(rèn)識(shí)BCSC-1的抑瘤作用，為腫瘤基因治療提供新的策略。

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Inhibition of malignant proliferation of human small cell lung cancer cells by ectopic expression of BCSC-1 gene

YUAN Fang, JU Ji-yu, TANG Yuan-yuan, DI Da-lin, WANG Li-na, SUN Ping(Department of Immunology, Weifang Medical University, Weifang Shandong 261053, China)

JU Ji-yu E-mail：jujiyu@163.com

Background and purpose：BCSC-1 gene has been proven to be a new tumor suppressor gene.This study explored the effects of ectopic expression of BCSC-1 gene on the proliferation of human small cell lung cancer NCI-H446 cell by transferring BCSC-1 gene.Methods：The BCSC-1 cDNA was amplified and inserted into pcDNA3.1/v5-HisB. pcDNA3.1/v5-HisB-BCSC-1 and pcDNA3.1/v5-HisB were transfected into wild-type NCI-H446 cells with liposome. FACSort fl ow cytometry analysis was performed to assess the cell cycle by propidium iodide (PI)stained DNA. The proliferation of cell was detected by MTT method. The expressions of BCSC-1 and CD44 were detected by immunohistochemistry.Results：Eukaryotic recombinant expression vector pcDNA3.1/v5-HisB-BCSC-1 was successfully constructed. A stable cell line expressing BCSC-1 protein was successfully established. Cell cycle analysis showed that the NCI -H446 cells with ectopic expression of BCSC-1 was mostly blocked in the G0/G1phase(P＜0.01). MTT assay showed that the growth of NCI-H446 cells with ectopic expression of BCSC-1 was inhibited(P＜0.05) compared with control and blank groups. The expressions of BCSC-1 and CD44 were higher in the NCI-H446 cells with ectopic expression of BCSC-1 compared with control and blank groups.Conclusion：Ectopic expression of BCSC-1 gene exerts profound inhibitory effect on the malignant proliferation of NCI-H446 cel1s. This inhibition may be related to the cell cycle arrest and increased expression of CD44.

BCSC-1 gene; NCI-H446 cell; Growth curve; Cell cycle; CD44

10.3969/j.issn.1007-3969.2012.05.003

R734.2

A

1007-3639(2012)05-0336-06

山東省自然科學(xué)基金(No: 2009CM019)；山東省教育廳資助項(xiàng)目(No: 2007WZ30)。

鞠吉雨 E-mail:jujiyu@163.com

2011-12-21

2012-03-21）