張新宇, 尹 榕, 付學鋒*, 趙 波, 萬東君

（蘭州軍區(qū)總醫(yī)院: 1干部病房, 2神經(jīng)內(nèi)科, 蘭州 730050；3蘭州軍區(qū)總醫(yī)院473臨床部神經(jīng)內(nèi)科，蘭州 730070）

隨著老齡化社會的到來, 阿爾茨海默?。ˋlzheimer′s disease, AD）越來越得到人們的重視。Humanin（HN）是新近發(fā)現(xiàn)的一種多肽, 它能抑制淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein, APP）、早老素 1（presenilin-1, PS1）、早老素 2（presenilin-2,PS2）突變和β淀粉樣蛋白（amyloid β-protein, Aβ）等誘導的神經(jīng)細胞死亡, 其在體外的抗細胞凋亡和神經(jīng)保護作用已經(jīng)被眾多研究者證實[1]。我們早期試驗已經(jīng)證實HN和HN肽鏈第14位氨基酸被Gly取代的突變體[Gly14]-Humanin（HNG）在體內(nèi)可有效地抑制 Aβ導致的膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）的表達, 本研究通過檢測HN對Aβ誘導的OX-42陽性細胞表達變化的影響, 旨在探討 HN在體內(nèi)對于小膠質(zhì)細胞是否同樣存在神經(jīng)保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

健康成年雄性昆明小鼠 60只, 2月齡, 體質(zhì)量25～30 g, 由蘭州軍區(qū)總醫(yī)院實驗動物中心提供, 清潔級。隨機分為假手術組（n=15）、Aβ模型組（n=15）和HN治療組（n=30）。

1.2 試劑

HN、Aβ25～35、羊抗兔OX-42單克隆抗體、鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶復合物（streptavidin biotin-peroxidase complex, SABC）為美國Sigma公司產(chǎn)品; 其他試劑均為市售分析純。

1.3 AD模型建立

參照Tihda等[2]的方法, 腹腔注射1%戊巴比妥溶液50 mg/kg, 麻醉小鼠, 固定于立體定向儀, 按照小鼠腦立體定位圖譜定位于右側(cè)海馬CA1區(qū)。應用微量注射器注入Aβ25～351 μl（注射時間10 min, 留針10 min）。HN治療組在注射Aβ后立即在同一部位緩慢注入 100 μmol/L HN 溶液 1 μl（注射時間 10 min, 留針10 min）。假手術組僅在相同部位入針, 操作同其他兩組。動物放置于安靜、溫暖、避強光的環(huán)境中飼養(yǎng)。

1.4 OX-42免疫組織化學染色

注射后分別于第3, 7, 14 d處死小鼠。鼠腦連續(xù)切片, 切片厚度 30 μm, 隔 4張取 1張。先后加入OX-42一抗（1:200）、二抗（1:500）、SABC（1:500）,采用硫酸鎳氨加強法DAB顯色, 操作按照說明書。陰性對照組采用同樣濃度的普通兔免疫球蛋白（IgG）代替一抗, 其他步驟相同。

1.5 尼式染色

冷凍切片經(jīng)二甲苯、無水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇下行入水, 后用1%焦油紫染色30 min。蒸餾水清洗, 70%乙醇分色數(shù)秒至數(shù)分鐘, 經(jīng)70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇各 2 min脫水, 無水乙醇脫水5 min, 二甲苯透明后樹膠封固。

1.6 圖像分析處理

采用Image pro plus 5.0軟件對組織切片進行定量分析。每只大鼠取4張切片, 200倍視野下, 于每張切片血腫周邊隨機選取 4個視野, 測出單位面積的OX-42陽性細胞數(shù)。

1.7 統(tǒng)計學處理

應用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件進行分析, 數(shù)據(jù)采用±s表示, 方差分析進行多組均數(shù)檢驗, 并用LSD-t檢驗進行多重比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組織化學方法檢測3組小鼠海馬區(qū)小膠質(zhì)細胞OX-42蛋白的改變

Aβ組小鼠經(jīng)Aβ刺激后3d, 小膠質(zhì)細胞被激活,轉(zhuǎn)化為活化狀態(tài), 以注射點為中心, 注射側(cè)海馬OX-42陽性細胞明顯深染、體積增大、數(shù)量增多, 并達到峰值; 細胞形態(tài)清楚, 胞體肥大、腫脹, 突起增粗延長; 注射對側(cè)海馬也出現(xiàn)活化 OX-42, 細胞增多、體積增大, 但較注射側(cè)弱; 隨時間延長, 7, 14d觀察可見 OX-42仍深染, 細胞數(shù)逐漸減少, 但仍多于假手術組, 胞體仍有肥大、突起增粗延長。而HN治療組在各時間段小膠質(zhì)細胞體積均明顯小于模型組, 且突起減少; 陽性細胞數(shù)目多于假手術組, 但少于模型組（P＜0.05; 圖1, 表1）。

2.2 尼式染色檢測3組小鼠海馬區(qū)病理改變

Aβ模型組、HN治療組在手術后各時間點Nissl染色可見皮質(zhì)有針刺道, 部分有皮質(zhì)缺損, 邊緣不整; Aβ模型組注射側(cè)海馬變形, 有明顯炎性細胞浸潤、腫脹以及膠質(zhì)細胞增生, CA1～CA3區(qū)錐體細胞消失或排列稀疏、紊亂, 其中炎性的病理變化在注射點最重, 其周圍逐漸減輕, 隨著時間的推移, 上述病理變化減弱; HN治療組在相同時間點炎性的病理變化弱于Aβ模型組。

3 討 論

老年斑是 AD的主要病理特征之一。在以 Aβ為核心的老年斑周圍聚集著大量活化的小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞, 同時在神經(jīng)纖維纏結(jié)、損傷的毛細血管周圍亦發(fā)現(xiàn)有大量的膠質(zhì)細胞存在, 但其密度最高的部位是在炎性老年斑內(nèi)及其周圍。在AD疾病的早期, 小膠質(zhì)細胞可吞噬外源性Aβ纖維, 吞噬Aβ后的小膠質(zhì)細胞被激活, 激活的小膠質(zhì)細胞在Aβ和神經(jīng)炎性斑塊等病理損害的細胞應答中具有重要作用。研究表明, 星形膠質(zhì)細胞活化后, 產(chǎn)生的炎性因子能夠促進Aβ聚集, 并進一步激活小膠質(zhì)細胞, 從而形成惡性循環(huán), 加重老年斑周圍的炎性反應[3]。越來越多的研究證據(jù)表明, 炎性反應在AD形成和發(fā)展過程中具有重要作用, 但迄今仍缺乏有效的防治措施[4]。

圖1 Aβ刺激后3d海馬OX-42陽性細胞Figure 1 Expression of OX-42 in hippocampal region on day 3 (SABC ×200)

圖2 海馬區(qū)病理改變Figure 2 Pathological changes of hippocampus on day 3 (Nissl staining ×200)

表1 3組小鼠海馬陽性OX-42細胞數(shù)的變化Table 1 Numbers of OX-42 positive cells in hippocampal region (n=15,±s)

表1 3組小鼠海馬陽性OX-42細胞數(shù)的變化Table 1 Numbers of OX-42 positive cells in hippocampal region (n=15,±s)

注: 與Aβ模型組比較, *P＜0.05

組別 3d 7d 14d假手術組 88.3±3.0 65.5±4.8 61.5±2.7 Aβ模型組 199.0±7.7 168.8±14.1 137.8±5.0 HN治療組 118.8±13.1* 113.6±9.1* 92.8±9.7*

HN是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的內(nèi)源性神經(jīng)保護因子, 由24個氨基酸殘基組成, 相對分子質(zhì)量為2656.3。HN是目前發(fā)現(xiàn)的一種既可以抑制多種黃素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide, FAD）引起的細胞毒性, 又可抑制Aβ神經(jīng)毒性的神經(jīng)保護因子[5]。體外研究證明, HN能夠抑制所有的由FAD突變體引起的神經(jīng)細胞死亡[6]; HN還能阻斷由Aβ和抗APP抗體在初級神經(jīng)元中引起的細胞毒性[7]; 眾多的體外研究表明, HN在微克水平即可表現(xiàn)出神經(jīng)保護作用[8]; Miao等[9]的實驗證實, HNG可以有效地改善實驗性AD小鼠神經(jīng)行為缺陷。我們先期的實驗發(fā)現(xiàn), HN及HNG在體內(nèi)均可有效地抑制Aβ毒性導致的GFAP表達, 這種改變有時間依賴特征, 與劑量及濃度顯著相關, 且HNG的生物活性作用較HN組更強[10]。

本研究通過觀察HN對AD模型小鼠海馬區(qū)小膠質(zhì)細胞表達的影響作用, 發(fā)現(xiàn)應用HN治療后, 海馬區(qū)Aβ注射中心的組織壞死區(qū)域范圍明顯縮小,OX-42的表達顯著減少。

總之, 本研究表明, HN在體內(nèi)可有效地抑制Aβ毒性導致的OX-42表達, 說明HN可以有效治療Aβ誘導的AD大鼠模型, 具有神經(jīng)保護作用。HN是否通過抗炎性反應途徑而發(fā)揮抗AD的神經(jīng)保護作用,仍需要進一步檢測其對炎性細胞介質(zhì)表達的影響加以證明。

[1]Chiba T, Nishimoto I, Aiso S,et al. Neuroprotection against neurodegenerative diseases: development of a novel hybrid neuroprotective peptide Colivelin[J]. Mol Neurobiol, 2007,35(1): 55-84.

[2]Tihda C, Tamura T, Komatsu K. Repair of amyloid beta(25-35)-induced memory impairment and synaptic loss by a Kampo formula, Zokumei-to[J]. Brain Res, 2003,990(1-2): 141-147.

[3]Li DB, Tang J, Fan XT,et al. Comparative study of histopathology changes between the PS1/APP double transgenic mouse model and Abeta1-40 -injected rat model of Alzheimer's disease[J]. Neurosci Bull, 2006, 22(1): 52-57.

[4]Tuppo EE, Arias HR. The role of inflammation in Alzheimer's disease[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2005, 37(2):289-305.

[5]Arakawa T, Niikura T, Kita Y. The biological activity of Humanin analogs correlates with structure stabilities in solution[J]. Int J Biol Macromol, 2011, 49(1): 93-97.

[6]Arakawa T, Kita Y, Niikura T. A rescue factor for Alzheimer's diseases: discovery, activity, structure, and mechanism[J].Curr Med Chem, 2008, 15(21): 2086-2098.

[7]胥顯民, 王廷杰, 陳顯久, 等. [Gly14]-Humanin多肽對 β淀粉樣蛋白引起的神經(jīng)干細胞毒性的拮抗作用研究[J].中國病理生理雜志, 2006, 22(8): 1623-1627.

[8]Rossini L, Hashimoto Y, Suzuki H,et al. VSTM2L is a novel secreted antagonist of the neuroprotective peptide Humanin[J]. FASEB J, 2011, 25(6): 1983-2000.

[9]Miao J, Zhang W, Yin R,et al. S14G-Humanin ameliorates Abeta25-35-induced behavioral deficits by reducing neuroinflammatory responses and apoptosis in mice[J].Neuropeptides, 2008, 42(5-6): 557-567.

[10]尹 榕, 李柱一, 苗建亭, 等. HN和HNG對AD小鼠海馬星形膠質(zhì)細胞激活影響的實驗研究[J]. 中華老年心腦血管病雜志, 2009, 11(6): 457-460.