王璐 鄧文騫 袁瓊嘉

成都體育學院（成都 610041）

缺血預處理（ischemic preconditioning，IP）是通過反復短暫缺血來調(diào)動機體內(nèi)源性保護機制從而延緩或減輕組織后續(xù)缺血再灌注損傷的現(xiàn)象。缺血預處理調(diào)動機體內(nèi)源性抗損傷能力，保護缺血的組織細胞。缺血預處理概念的提出，為防治缺血/再灌注損傷開拓了新的研究領域。腦缺血預處理（neuronal ischemic preconditioning，NIPC）是由一種或多種低于永久性損害刺激引起的機體內(nèi)在的神經(jīng)保護措施，能使神經(jīng)系統(tǒng)增強抵抗致死性缺血性損害的能力，不易形成永久性缺血損害[1]。缺血預處理對腦保護作用的發(fā)現(xiàn)，為內(nèi)源性神經(jīng)保護機制和神經(jīng)保護治療方法提供了新的啟示和研究方向。在運動醫(yī)學領域，利用預處理抗疲勞、提高運動能力的研究較多[2]，主要通過針刺[3，4]、藥物[5，6]、溫度等方式預防運動疲勞；利用運動作為刺激源，引起機體缺血——運動預處理（exercise preconditioning，EP），如此重復數(shù)次后，使運動員能持續(xù)進行較長時間、更劇烈的運動[7]，如利用高住低練、高原訓練的方式提高運動成績，亦屬于預處理在運動醫(yī)學領域的運用。

運動預處理作為一種特殊的缺血缺氧預處理，其作用機制尚不十分明了，其對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的保護作用及機制研究尚屬起步階段，前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)運動預處理可以減少大鼠海馬細胞的凋亡程度，對大鼠海馬細胞產(chǎn)生一定的保護作用[8]。作為對運動性缺血缺氧最為敏感的部位大腦皮質(zhì)神經(jīng)元[9]，運動預處理是否對其也存在保護作用，保護機制如何？通過建立運動預處理模型，本研究探討運動預處理對大腦皮質(zhì)的保護作用。

1 材料與方法

1.1 動物及其分組

4月齡成年雄性SPF級SD大鼠40只，購自四川大學華西醫(yī)學中心實驗動物中心，生產(chǎn)許可證編號：SCXK（川）2009-09；使用許可證編號：SYXK（川）2009-045，動物批號：20100302。大鼠隨機分為空白對照組（C 組，n=8），力竭運動組（EE 組，n=16）和運動預處理組（EP 組，n=16）。

1.2 實驗造模

C組常規(guī)喂養(yǎng)。EE組：前3天進行無負重10 min適應性游泳，隨后和C組一樣常規(guī)喂養(yǎng)，4周后，進行一次性力竭游泳。EP組：前3天進行無負重10 min適應性游泳，從第4天開始進行不負重中等負荷游泳訓練，60 min/d，6 d/w，持續(xù)4周。末次運動24 h后進行一次性力竭游泳。力竭標準[10]：1）大鼠沉入水下無法返回水面超過10 s；2）大鼠協(xié)調(diào)運動消失，在水中無方向性地亂竄，雖未達到10 s亦定為力竭。

1.3 取材

根據(jù)后期實驗方法的不同要求，采用直接取材冷凍保存和灌注取材兩種取材方法。

直接取材冷凍保存：EE組和EP組進行一次性力竭游泳，力竭后即刻撈出水面，每組隨機取8只大鼠處死，迅速破壞其頭蓋骨取出大腦組織，剝離大腦皮質(zhì)部分，隨即放入液氮中冷凍保存，用于提取組織總蛋白做免疫蛋白印跡檢測。

灌注取材：EE組和EP組剩余各8只大鼠按2.3 ml/kg體重腹腔注射剛配制的2%戊巴比妥鈉。將其仰臥，縛住四肢及頭部，然后打開大鼠的胸腔，暴露心臟，快速地通過左心室向主動脈插進針頭，用止血鉗固定心尖部及針頭，先后用生理鹽水和4%多聚甲醛灌注，直到上肢及頭部肌肉痙攣漸硬、變白，待灌注液從鼻中流出，則關閉多聚甲醛開關。用斷頭鍘將頭取下，用剪刀自枕骨大孔兩側沿耳朵稍后上方各剪一刀（注意不要破壞腦組織），翻起顱骨，將大腦輕輕取下，置于托盤中，在視交叉后1 mm及4 mm處沿冠狀切面切開，取中間塊放入裝有4%甲醛固定液的小瓶中浸泡固定，室溫貯存，以備石蠟包埋做HE染色及免疫組化檢測用。

C組大鼠不游泳，按以上方法提前一天取材。所有實驗均在成都體育學院國家體育總局運動醫(yī)學重點實驗室完成。

1.4 HE染色和免疫組化染色

取出甲醛固定大腦組織，乙醇脫水，二甲苯透明，包埋于石蠟中，蠟塊置4℃冰箱中備用。

從4℃冰箱中取出蠟塊，做4 μm額狀面切片，連續(xù)切片每隔4張取4張切片，每個石蠟標本共取8張切片，均參照包新民等[11]著《大鼠腦立體定位圖譜》辨認大腦皮質(zhì)部位。

每連續(xù)4張切片取出其中的第1張切片進行HE染色，觀察大腦皮質(zhì)結構；取出第2、3、4張切片，分別用SP法（Streptavidin-peroxidase，鏈親和素法）標記大腦皮質(zhì)的Bcl-2和Bax表達情況。一抗為小鼠Bcl-2單克隆抗體濃縮液0.1 ml（美國Santa Cruz公司），小鼠Bax單克隆抗體濃縮液0.1 ml（美國Santa Cruz公司）。二抗為山羊抗鼠IgG（Cell Signal）抗體。

將免疫組織化學切片在計算機圖像采集分析系統(tǒng)（Nikon&SPOT美國生產(chǎn)，軟件為Version3.0）上采集圖像（采圖位置嚴格限定在大腦皮質(zhì)區(qū)，每1例采圖不少于5幅，且圍繞一個中心位點連續(xù)采圖）。采用Image Pro-Plus（IPP）圖像分析軟件定量分析Bcl-2和Bax蛋白表達。

1.5 Western-blot檢測

從液氮中取出保存的標本，同時進行Bcl-2蛋白和Bax蛋白Western-blot檢測。標本放入預冷研缽充分短時研磨，按500 μl/100mg標準加入蛋白裂解液至研缽沖洗研磨好的組織，充分混勻后將懸液放入EP管中，蛋白裂解液購自北京百泰克生物試劑公司，臨用前加蛋白酶抑制劑：PMSF[174 mg/10ml（異丙醇）]1%；Leupeptin （1 mg/ml）1/500；Pepstatin A（5 mg/ml）1/1000。將懸液放在冰上冰浴 20 分鐘，確保裂解充分，隨后14000 r/min 4℃離心20分鐘，收集上清，即大鼠大腦皮質(zhì)總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒（購自武漢博士德生物工程有限公司）對各標本總蛋白進行定量檢測。各標本取20μg總蛋白加入上樣緩沖液后于熱板上煮10分鐘，隨后進行SDS-PAGE電泳，電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜，進行免疫印記檢測。Western-blot所用抗體同免疫組化實驗抗體。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用SPSS13.0進行統(tǒng)計。實驗結果均以“均數(shù)±標準差”表示，組間差異采用t檢驗兩兩比較；P<0.05時差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HE染色結果

200倍光鏡下（圖1），可見C組大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元排列整齊，細胞間質(zhì)勻稱、致密；EE組大腦皮質(zhì)神經(jīng)元排列紊亂，多數(shù)細胞固縮且出現(xiàn)染色加深，細胞間質(zhì)疏松，甚至出現(xiàn)空泡；EP組大腦皮質(zhì)神經(jīng)元排列整齊，細胞間質(zhì)勻稱、致密。400倍光鏡下（圖2），可見C組細胞形態(tài)完整，細胞質(zhì)勻稱，細胞核清晰可見；EE組細胞染色加深，無法辨認細胞核，但細胞形態(tài)較完整；EP組細胞形態(tài)完整，細胞質(zhì)勻稱，細胞核清晰可見，但仍有部分神經(jīng)元出現(xiàn)染色加深。

圖1 各組大鼠大腦皮質(zhì)HE染色（×200）

圖2 各組大鼠大腦皮質(zhì)HE染色（×400）

2.2 Bcl-2和Bax免疫組化染色結果

由圖3可見：EE組和C組Bcl-2陽性表達較弱，EP組Bcl-2蛋白表達強度增加。由圖4可見，C組大腦皮質(zhì)未見明顯Bax陽性表達，EE組大腦皮質(zhì)Bax陽性表達強度較C組升高，EP組大腦皮質(zhì)Bax陽性表達強度較C組也有所升高。

各組大鼠大腦皮質(zhì)Bcl-2和Bax免疫組化染色經(jīng)Image Pro-Plus（IPP）圖像自動分析系統(tǒng)分析后結果如表1。EP組大鼠大腦皮質(zhì)Bcl-2表達較C組和EE組升高，差異具有統(tǒng)計學意義；EE組大鼠大腦皮質(zhì)Bax表達較C組和EP組升高，差異具有統(tǒng)計學意義。

表1 各組大鼠大腦皮質(zhì)免疫組化檢測Bcl-2和Bax表達結果比較

圖3 各組大鼠大腦皮質(zhì)Bcl-2免疫組化染色（×200）

圖4 各組大鼠大腦皮質(zhì)Bax免疫組化染色（×200）

2.3 Western-blot結果

由圖5可見：各組Bcl-2蛋白表達存在差異，C組和EE組表達較弱，EP組表達較強。Bax蛋白同樣有差異（圖6），C組表達較弱，EE組表達增強，EP組表達較C組也明顯增強。

圖5 各組大鼠大腦皮質(zhì)Bcl-2蛋白Western-blot檢測

圖6 各組大鼠大腦皮質(zhì)Bax蛋白Western-blot檢測

3 討論

運動作為一種刺激對機體可產(chǎn)生有益或有害的雙向影響。劇烈運動導致全身血液的重新分配，使腦相對缺血、缺氧，而腦對缺血、缺氧極為敏感。大腦在力竭運動時處于相對缺血、缺氧狀態(tài)，腦細胞自由基產(chǎn)生增加，出現(xiàn)神經(jīng)細胞線粒體鈣超載，并發(fā)生缺血、缺氧性損傷[12，13]，這些都是腦細胞凋亡的誘發(fā)因素。所以過度疲勞或一次性力竭運動都會導致中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞凋亡。本實驗前期研究發(fā)現(xiàn)，一次性力竭運動后大鼠大腦海馬神經(jīng)元排列紊亂，細胞間質(zhì)疏松，大量細胞出現(xiàn)空泡，細胞凋亡明顯增加，表明一次性力竭運動會引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細胞凋亡，對神經(jīng)系統(tǒng)造成傷害。

大腦皮層作為中樞神經(jīng)的中樞，是最高級別的運動控制中樞[14]，大腦皮質(zhì)神經(jīng)元對運動性缺血缺氧最敏感，其疲勞影響整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)。Li等[15]發(fā)現(xiàn)，短時間局灶性腦缺血后，凋亡細胞散在出現(xiàn)于視前區(qū)和紋狀體，然后擴展至大腦皮質(zhì)，而長時間缺血后，整個病灶中均有散在的凋亡細胞。關于運動是否改變大腦血流狀況，袁瓊嘉等[16]研究力竭運動對大鼠微循環(huán)的影響后發(fā)現(xiàn)：力竭運動后即刻，大鼠大腦出現(xiàn)明顯的微循環(huán)障礙。本研究發(fā)現(xiàn)，力竭運動組大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元排列紊亂，多數(shù)細胞固縮，細胞間質(zhì)疏松，甚至出現(xiàn)空泡，高倍光鏡下可見細胞染色加深，無法辨認細胞核，說明力竭運動造成大鼠大腦皮質(zhì)細胞凋亡增加，其原因可能是劇烈運動時大腦相對缺血。如果通過某種預處理減少缺血對大腦皮質(zhì)的損傷，將對整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)都起到保護作用。

在運動醫(yī)學領域，利用中等負荷運動預處理減少大強度運動對腦損傷的研究較少。本實驗前期研究已證實，中等運動預處理可減輕一次性力竭運動引起的大鼠海馬細胞凋亡程度，對大鼠海馬細胞產(chǎn)生一定的保護作用[8]。本實驗同樣將運動作為一種預防手段，發(fā)現(xiàn)預處理組大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元形態(tài)結構完好，細胞凋亡程度較力竭組明顯減輕。這說明運動預處理能減少力竭運動誘導的大鼠大腦皮質(zhì)缺血缺氧引起的細胞凋亡，對大腦皮質(zhì)有一定的保護作用。

自1990年發(fā)現(xiàn)腦缺血預處理誘導腦缺血耐受以來，這種通過激發(fā)自身機制對再次嚴重腦缺血產(chǎn)生保護作用的方法受到廣泛關注。腦缺血耐受實際是外界刺激激活機體內(nèi)在的保護機制，增加了對下一次嚴重損傷的抵抗。王金春等[17]實驗研究表明，腦缺血預處理是通過抗凋亡機制產(chǎn)生缺血耐受作用，即Bcl-2表達增加。趙剛等[18]實驗研究表明，20 min局部腦缺血預處理能通過Bcl-2表達增加及Bax表達下降對再次腦缺血神經(jīng)細胞起保護作用。胡永善等[19]研究表明：預運動訓練可減小隨后發(fā)生的腦缺血損傷的腦梗死體積，對腦缺血損傷具有一定的保護作用。這與本研究結果吻合。通過免疫組化和蛋白免疫印跡法，我們發(fā)現(xiàn)常壓常氧狀態(tài)下，運動預處理組Bcl-2表達強度高于對照組和一次性力竭運動組，而運動預處理組Bax表達較一次性力竭運動組也增強，但程度小于Bcl-2蛋白表達，表明中等負荷的運動預處理可以通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)凋亡相關蛋白的表達誘導抗凋亡，進而對大腦皮質(zhì)產(chǎn)生保護作用。

至于運動預處理影響B(tài)cl-2和Bax蛋白表達從而產(chǎn)生保護的機制，推測同低氧預適應的機制相似。Bcl-2和Bax分別是調(diào)節(jié)細胞凋亡分子家族中的重要成員[20]，細胞受到缺血/缺氧損傷時，首先啟動Bcl-2基因表達以抑制細胞凋亡。預處理后，調(diào)動機體內(nèi)源性抗缺氧機制，使Bcl-2高表達，通過與Bax競爭結合，形成異源二聚體，封閉Bax形成孔道的活性，阻止cty-c穿過線粒體膜進入細胞質(zhì)參與形成凋亡啟動復合體，激活Caspase的級聯(lián)反應，最終抵抗細胞凋亡[21，22]。本實驗結果從細胞凋亡角度證明，中等負荷運動預處理對一次性力竭運動導致大腦皮質(zhì)細胞凋亡具有保護作用，其作用機制正在研究中。

4 總結

力竭運動可誘導大鼠大腦皮質(zhì)細胞凋亡增加。運動預處理能減少力竭運動誘導的大鼠大腦皮質(zhì)細胞凋亡，對大腦皮質(zhì)細胞產(chǎn)生保護作用。運動預處理可能通過影響B(tài)cl-2和Bax蛋白表達從而對細胞凋亡起調(diào)控作用。

[1]Nandagopal K，Dawson TM，Dawson VL.Critical role for nitric oxide signaling in cardiac and neuronal ischemic preconditioning and tolerance.J PharmacolExp Ther，2001，297（2）：474-478.

[2]王岸新，宋吉銳.預處理技術的研究現(xiàn)狀及其在運動訓練中的應用前景.北京體育大學學報，2007，30 （10）：1384-1385.

[3]丁曉蓉，于建春，于濤，等.針刺對快速老化小鼠SAMP10皮質(zhì)衰老相關基因表達譜的影響.上海針灸雜志，2006，25（1）：39.

[4]孫忠人，唐偉，單麗莉.針刺誘導腦缺血耐受的實驗研究.中國臨床康復，2005（9）：122-123.

[5]余謙，李明富，宋開源，等.中醫(yī)藥抗體力性疲勞的整體思辨與應用前景.中國運動醫(yī)學雜志，2001，20（1）：3-4.

[6]文繼月，陳志武.藥物預處理的腦保護作用.淮南職業(yè)技術學院學報，2006（4）：119-121.

[7]張梅，何葉.不同強度運動訓練對大鼠大腦皮質(zhì)CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡的影響.山東體育學院學報，2006，21（6）：151-153.

[8]王璐，袁瓊嘉.運動預處理對力竭運動誘導的大鼠海馬細胞凋亡的影響.體育科學，2009，3（29）：52-57.

[9]袁瓊嘉，蘇全生，熊若虹，等.不同強度運動對大腦皮質(zhì)血管內(nèi)皮細胞生長因子 （VEGF）的影響.成都體育學院學報，2009，12（35）：71-73.

[10]Kirino T.Ischemic tolerance.J Cereb Blood Flow Metab，2002，22（11）：1283-1296.

[11]包新民，舒斯云.大鼠腦立體定位圖譜.北京：人民衛(wèi)生出版社，1991.28-36.

[12]王來栓，邵肖梅.線粒體與缺氧缺血性腦細胞凋亡.國外醫(yī)學腦血管疾病分冊，2003，11（1）：65-67.

[13]印克杰，孫鳳艷.腦缺血中細胞凋亡發(fā)生的多元調(diào)節(jié)機制.中國藥理學通報，1998，14（l）：11-13.

[14]徐科.神經(jīng)生物學綱要.北京：科學出版社，2000.274-285.

[15]Li Y，Chopp M，Jiang N，et al.Induction of DNA fragmentation after 10 to 120 minutes of focal cerebral ischemia in rats.Stroke，1995，26（7）：1252-1257.

[16]袁瓊嘉，田佳，畢新奇，等.力竭運動對大鼠微循環(huán)的影響.成都體育學院學報，1994，3（20）：94-96.

[17]王金春，孫鋒，宋利春.大鼠局灶腦缺血預處理的腦保護機制探討.中國神經(jīng)免疫學和神經(jīng)病理雜志，2004，11（4）：209-210.

[18]趙剛，鄧艷秋，焦卓敏，等.大鼠局灶性腦缺血預處理的抗細胞凋亡作用機制的研究.臨床神經(jīng)病學雜志，2002，15（6）：323-325.

[19]胡永善，賈杰，吳毅，等.預運動訓練對腦梗死大鼠腦保護作用的興奮性氨基酸遞質(zhì)效應.中國康復醫(yī)學雜志，2008，23（7）：589-593.

[20]張顏波，呂國蔚，楊明峰，等.低氧預適應小鼠海馬Bcl-2表達和Caspase-3活性的變化.中華神經(jīng)科雜志，2007，40（8）：553-555.

[21]劉傳軍，李躍，高慧英.缺氧缺血性腦病新生大鼠發(fā)育期間海馬神經(jīng)元的變化與康復.中國新生兒科雜志，2007，22（3）：145-148.

[22]Hua F，Cornejo MG，Cardone MH，et al.Effects of Bcl-2 levels on Fas signaling-induced caspase-3 activation：molecular genetic tests of computational model predictions.Immuno，2005，175（2）：985-995.