李宏云 陳疾忤 陳世益 陳始秋 張慶國

復(fù)旦大學運動醫(yī)學中心 復(fù)旦大學附屬華山醫(yī)院運動醫(yī)學與關(guān)節(jié)鏡外科（上海 200040）

骨骼肌損傷在運動醫(yī)學中很常見，發(fā)病率約10%～55%[1]。 休息、冰敷、加壓、制動、藥物和康復(fù)鍛煉等現(xiàn)有治療方法，對于減少瘢痕形成、促進肌肉再生的作用有限[2]。嚴重損傷的骨骼肌常難以完全修復(fù)，在經(jīng)過炎性階段后，纖維組織與生肌組織同時增生，然而纖維組織增生的速度要比肌肉再生的速度快，最終導(dǎo)致瘢痕形成遠多于有功能的再生肌肉。因此纖維化是肌肉再生修復(fù)過程中的一大障礙。損傷處瘢痕組織不具有肌肉的生物力學性能，造成其功能下降，容易再次受傷[3]。

TGF β作為一種促纖維化因子，有促進細胞外基質(zhì)的形成，促進成纖維細胞合成膠原蛋白、纖維粘蛋白及蛋白多糖等細胞外基質(zhì)，促進細胞外基質(zhì)蛋白特異性表面膜受體表達的作用[4]。TGF β的纖維化作用主要通過TGF β－Smad信號通路調(diào)控。Smad4是該信號通路中一個重要的蛋白，其與不同Smad蛋白的協(xié)同作用是TGF β超家族信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，同時涉及Smad4下游調(diào)控或者交互對話信號通路，在整個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本課題組成員之前的研究，已成功構(gòu)建以慢病毒為載體的Smad4 siRNA，轉(zhuǎn)染C2C12成肌細胞后，發(fā)現(xiàn)可抑制C2C12細胞的Smad4表達，并抑制成肌細胞纖維化過程[5]。本實驗采用RNA干擾方法，利用慢病毒載體將Smad4的RNA干擾片斷植入小鼠體內(nèi)，了解其對在體骨骼肌纖維化抑制作用及對骨骼肌愈合能力的影響，以期其長期發(fā)揮抑制Smad4基因表達，降低Smad4蛋白分泌，阻斷TGF β－Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用，最終達到抑制骨骼肌纖維化，提高骨骼肌愈合質(zhì)量的目的。如能達到研究目的，將對骨骼肌損傷的治療提供又一種嶄新的方法和手段。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

體重20～25 g雌性C57bl小鼠共60只，由中國科學院上海實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（滬）2009-0019。按國家標準嚙齒類動物飼料飼養(yǎng)于復(fù)旦大學動物實驗部。自由攝食飲水，動物房溫度21～23℃，相對濕度 40%～60%。

1.2 骨骼肌鈍挫傷模型建立

采用Kasemkijwattana等[2]的骨骼肌鈍挫傷模型造成實驗小鼠骨骼肌鈍挫傷，打擊前10%水合氯醛（0.3 ml/100g）腹腔注射麻醉，將小鼠后肢置于伸膝、踝背屈90°位置上，采用重物高空垂直下落造成打擊傷，損傷部位為小鼠右下肢腓腸肌內(nèi)側(cè)面中段。致傷物為一段固體木制圓柱體，打擊面直徑為0.8 cm，打擊物質(zhì)量為16.7 g，從1 m高空垂直下落。解剖證實打擊致傷率100%。

1.3 動物分組

54只小鼠隨機分成①PBS對照組、②Smad4 siRNA注射組、③scrambled siRNA注射組三組，每組18只。小鼠打擊傷后10天，分別在三組損傷部位注射 PBS 0.1 ml、Smad4 siRNA （濃度 1×106ifu/μl）、scrambled siRNA（濃度 1×106ifu/μl）。 Smad4 siRNA是以慢病毒為載體的Smad4 siRNA，scrambled siRNA是作為對照的、以慢病毒為載體的亂序siRNA，由本課題組在之前的研究中構(gòu)建成功[5]。于右后肢鈍挫打擊傷后第28天，脫頸處死各組小鼠后在腓腸肌損傷部位取材。完整取出右下肢腓腸肌后備用（用于生理學檢測的小鼠取雙下肢腓腸?。?，其中6只用于免疫組化染色檢測，6只用于Real Time-PCR和Western blot檢測，6只用于生理學檢測。另6只小鼠未進行骨骼肌打擊傷，作為正常對照，用于生理學檢測。

1.4 Real Time-PCR檢測

按Trizol試劑盒（美國Invitation公司）說明書抽提RNA總量，按M-MLV、SYBR Premix Ex Taq試劑盒（日本Takara公司）說明書進行逆轉(zhuǎn)錄、擴增。βactin為內(nèi)參。Smad4上游引物為5’-CGGCCGTGGCAGGGAACA-3’， 下游引物為 5’-CTGCAGAGCTCGGTGAAGGTGAAT-3’， 長度為 215bp；βactin上游引物為 5’-CCTCTATGCCAACACAGTGC-3’，下游引物為5’-GTACTCCTGCTTGCTGATCC-3’，長度為 211 bp。PCR 反應(yīng)體系 20 μl。 反應(yīng)條件為 95℃、10 s，60℃、20 s，72℃、20 s，40 個循環(huán)。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行分析。

1.5 Western blot檢測

取出液氮保存的組織，使用無菌手術(shù)刀于干冰上切取100 mg大小，轉(zhuǎn)移到1.5 ml無菌離心管，加入0.5 ml 4℃預(yù)冷的蛋白裂解液，使用電動勻漿器進行組織勻漿。SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)PVDF膜。將PVDF膜用5%脫脂奶粉（奶粉溶解于TBST中）封閉1 小時，加入一抗 Smad4（1∶500，美國 Santa Cruz公司）、GAPDH （1∶800， 美國 Cell Signaling 公司），用TBST稀釋，4℃過夜。然后加入二抗 （1∶3000，美國Cell Signaling公司）在室溫下反應(yīng)2小時后，ECL發(fā)光法檢測Smad4蛋白表達。

1.6 熒光檢測

切取三組小鼠損傷部位的腓腸肌及Smad4 siRNA注射組小鼠的肝臟，OCT包埋，放入經(jīng)液氮預(yù)冷的丙酮中，速凍1 min；將標本置于冰凍切片機上，以5 μm層厚切片，貼于涂APES的防滑載玻片上，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白 （Green Fluorescent Protein，GFP）在組織中的表達。

1.7 免疫組化檢測

切取的腓腸肌標本在10%中性福爾馬林中固定3 d后脫水，石蠟包埋，于腓腸肌中間部分縱行切片，厚15 μm，隨后按masson染色試劑盒（廈門邁威生物科技有限公司）說明書操作進行Masson染色。免疫組化染色檢測Vimentin表達 （Vimentin一抗稀釋濃度1∶500，美國Sigma-Aldrich公司，二抗稀釋濃度1∶1000，美國 Cell Signaling 公司）。 在 Nikon80i顯微鏡下觀察，采用NIS-Elements BR2.30圖像分析系統(tǒng)進行分析，每張切片在40倍鏡隨機觀察5個視野，記錄并比較三組小鼠染色陽性區(qū)域和免疫組化陽性值（陽性強度×陽性面積）差異。

1.8 生理學檢測

鼠頸椎脫臼法處死后，立即仔細分離雙側(cè)下肢腓腸肌，自腱骨結(jié)合部切下，放入恒溫水浴槽中，并浸泡于 Krebs液（NaCl 113、KCl 4.7、CaCl21.25、Mg-SO41.2、KH2PO41.2、NaHCO325.0、葡萄糖 11.5，單位mmol/L）中，一端固定于水浴槽底部，另外一端固定于張力傳感器上，再將信號傳輸至生物信號采集處理系統(tǒng)儀器中。測試前標定力和位移的傳感器，并將肌肉調(diào)整至最適初長度。初始張力調(diào)整為20 mN，平衡20 min后，電刺激腓腸肌，記錄肌肉的快速顫搐收縮和強直收縮，并取其平均值。

為了減小個體差異及測試時間所造成的誤差，將每只小鼠傷側(cè)快速顫搐收縮及強直收縮數(shù)值與健側(cè)的比值作為參數(shù)進行統(tǒng)計學比較。

1.9 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，多組之間采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義，P<0.01為差異具有高度統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 熒光顯微鏡下觀察病毒在體轉(zhuǎn)染骨骼肌的情況

傷后28天小鼠體內(nèi)GFP表達：在Smad4 siRNA注射組和scrambled siRNA注射組小鼠腓腸肌注射病毒部位均檢測到GFP熒光，但在PBS對照組小鼠骨骼肌內(nèi)和Smad4 siRNA注射組小鼠肝臟組織內(nèi)未檢測到GFP熒光表達（見圖1），表明除注射局部外，未發(fā)現(xiàn)遠處臟器有目的基因表達，采用慢病毒載體局部注射轉(zhuǎn)染目的基因安全、有效。

2.2 組織Smad4基因和蛋白表達

圖2顯示，Smad4siRNA注射組骨骼肌組織Smad4基因及蛋白表達明顯低于scrambled siRNA注射組和PBS對照組，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01），表明局部注射以慢病毒為載體的Smad4 siRNA能抑制損傷骨骼肌Smad4表達。

2.3 骨骼肌組織疤痕形成的情況

圖3中，疤痕顯示為藍色，肌肉組織顯示為紅色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Smad4 siRNA注射組疤痕明顯少于對照組和scrambled siRNA注射組，差異具有高度統(tǒng)計學意義 （P<0.01），表明局部注射慢病毒介導(dǎo)的Smad4 siRNA可明顯抑制骨骼肌損傷后的纖維化，減輕疤痕生成。

2.4 骨骼肌組織vimentin表達

圖4顯示，棕黃色為Vimentin陽性染色，反映纖維化的嚴重程度。Smad4 siRNA注射組vimentin明顯少于對照組和scrambled siRNA注射組，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01），表明局部注射慢病毒介導(dǎo)的Smad4 siRNA可抑制骨骼肌損傷后的纖維化，減輕疤痕生成。

2.5 生理學檢測結(jié)果

圖3 各組小鼠骨骼肌損傷愈合過程中的疤痕形成情況

圖4 各組小鼠骨骼肌損傷愈合過程中的纖維化情況

圖5顯示，Smad4 siRNA注射組小鼠腓腸肌強直收縮和快速顫搐收縮明顯高于PBS對照組和scramble siRNA注射組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），表明Smad4 siRNA注射組骨骼肌損傷愈合質(zhì)量優(yōu)于PBS對照組和scramble siRNA注射組，局部注射慢病毒介導(dǎo)的Smad4-siRNA能有效促進小鼠骨骼肌損傷愈合。

圖5 各組小鼠強直收縮和快速顫搐收縮測試結(jié)果

3 討論

骨骼肌損傷后，損傷肌肉殘端之間的空隙最初由血腫充填。血腫機化形成的纖維素交織形成基質(zhì)，作為侵入的成纖維細胞支架。為了恢復(fù)結(jié)締組織的完整性，成纖維細胞開始合成蛋白質(zhì)和細胞外基質(zhì)大分子。Ⅰ、Ⅲ型膠原及纖連蛋白的合成可以作為再生肌纖維的骨架，使再生肌纖維能與細胞外基質(zhì)中的蛋白接觸，在損傷間隙傳導(dǎo)收縮力[6]。在肌肉嚴重損傷時，成纖維細胞迅速增殖導(dǎo)致瘢痕組織過度增生，形成機械性屏障，阻礙了損傷區(qū)域骨骼肌的再生，并易再發(fā)損傷，使病情反復(fù)遷延難愈。因此，早期應(yīng)及時采用正確治療手段，盡可能限制血腫范圍，避免成纖維細胞過度增生以及瘢痕過度形成，影響愈合質(zhì)量。

在骨骼肌損傷愈合過程中，TGF β-Smad信號通路對纖維化的調(diào)控作用非常重要。直接在小鼠損傷骨骼肌部位注射外源性IFN-γ，能夠抑制骨骼肌纖維化，提高愈合質(zhì)量[7，8]。IFN-γ 可引起 TGF β－Smad信號通路中的抑制型蛋白Smad7表達升高，通過Smad7阻斷該信號通路向下傳導(dǎo)，從而抑制TGF β的作用[9]。直接在小鼠骨骼肌損傷部位注射能夠抑制TGF β與受體結(jié)合的藥物，也可抑制骨骼肌纖維化的發(fā)生，提高骨骼肌損傷修復(fù)的質(zhì)量[10，11]。 此外，在心肌、皮膚、腎臟、肺等多種組織中均發(fā)現(xiàn)TGF β－Smad信號通路與纖維化關(guān)系非常密切[12-14]。

Smad蛋白家族成員作為TGF β下游的受體激酶，在TGF β信號通路中發(fā)揮著重要的介導(dǎo)作用。迄今為止，哺乳動物中發(fā)現(xiàn)了8種不同的Smads家族成員。根據(jù)他們的結(jié)構(gòu)和功能不同，Smads被分為3 個亞族：（1）受體激活的 Smads（R-Smads），包括Smad1、2、3、5、8， 它們可與 TGF β 受體直接作用并磷酸化，之后再與Smad4結(jié)合為二聚體轉(zhuǎn)位入核；（2）通用型Smad（Co-Smad），目前在人類僅發(fā)現(xiàn)Smad4，是所有R-Smads的結(jié)合配體，并促進RSmads轉(zhuǎn)移入細胞核，可與Smads家族其他成員相互作用形成穩(wěn)定的異源多聚體，轉(zhuǎn)位入核后調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄；（3）抑制型 Smads（I-Smads），包括 Smad6、7，為TGF β-Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的負向調(diào)節(jié)因子，可與R-Smads競爭性結(jié)合受體，阻止R-Smads磷酸化，從而阻斷TGF β的生物學效應(yīng)。Smad4是該條信號通路中極重要的一個蛋白，它與不同的Smad蛋白的協(xié)同作用是TGF β超家族信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，同時涉及Smad4下游調(diào)控或者交互對話信號通路，在整個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[15，16]。

RNA干擾（RNAi）是正常生物體內(nèi)抑制特定基因表達的一種現(xiàn)象，是指當細胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA時，該mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達沉默的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，又稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默。RNAi與傳統(tǒng)基因治療方法相比具有諸多優(yōu)勢：其基因沉默效能極強，具有很高的序列特異性，作用效果可在細胞間持久傳遞，且能夠通過去除載體的方法終止其基因沉默的效果[17，18]。

慢病毒作為目前轉(zhuǎn)染效率最高的基因治療載體，其最大的優(yōu)勢在于能夠?qū)⒒蛘现涟屑毎蚪M，獲得更穩(wěn)定持久的表達。早期研究中最常見的是靜脈注射，由于其便捷有效得到了廣泛應(yīng)用。但全身性用藥使大部分siRNA被非靶向組織攝取，這些組織中靶基因的沉默將不可避免地引起嚴重副作用。另一方面，靜脈注射的轉(zhuǎn)染效率也受到影響，需要增大病毒液用量。Wolf[19]研究發(fā)現(xiàn)，將質(zhì)粒DNA直接注射到心肌和骨骼肌，可獲得外源DNA表達，證實了原位轉(zhuǎn)染的可行性，同時也為外源性基因轉(zhuǎn)染組織提供了新途徑。近年來，出現(xiàn)了一些慢病毒局部注射的方法，包括玻璃體內(nèi)、小腦內(nèi)、鼻內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)等[20-24]，以期減輕靜脈注射的毒副作用，同時提高病毒轉(zhuǎn)染效率。以往研究發(fā)現(xiàn)，局部注射可避免全身其他組織及血液中靶基因的沉默效應(yīng)[23，24]。本研究也發(fā)現(xiàn)，將慢病毒液直接注射至小鼠損傷骨骼肌局部，未發(fā)現(xiàn)報告基因GFP在體內(nèi)其他組織表達，也未發(fā)現(xiàn)其他組織Smad4基因及蛋白表達受到抑制。這表明采用慢病毒局部注射方法能夠成功將目的基因轉(zhuǎn)染小鼠損傷局部的骨骼肌細胞，并可長期抑制Smad4基因及蛋白表達，而不會遠處轉(zhuǎn)染其他臟器，是一種安全有效的方法。

基因治療中更為重要的是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物表達時間的長短，表達時間太短則不能達到基因治療的目的。Kyosen等[25]將慢病毒液通過靜脈注射的方法注射至小鼠體內(nèi)，注射后24周時在骨骼肌及心肌組織內(nèi)仍能檢測到轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的表達。慢病毒局部直接注射后也能長時間表達轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物。Jeon等[26]采用直接注射方法將慢病毒液直接注射至大鼠骨骼肌，注射后2個月仍能檢測到轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的表達。本研究將RNAi技術(shù)與慢病毒載體結(jié)合，單次局部注射慢病毒介導(dǎo)的siRNA后，直至小鼠骨骼肌傷后4周仍能發(fā)現(xiàn)報告基因GFP在注射部位的穩(wěn)定表達，且注射局部的Smad4基因和蛋白水平表達降低，證實慢病毒載體將靶向Smad4 siRNA整合至骨骼肌細胞內(nèi)，可長時期穩(wěn)定發(fā)揮RNAi的干擾作用，其作用時效遠遠高于傳統(tǒng)單次給藥或瞬時轉(zhuǎn)染，有助于治療大面積嚴重骨骼肌損傷。另外，骨骼肌損傷修復(fù)是一個漫長的過程，穩(wěn)定持久的基因沉默效果有助于降低用藥頻率，減少全身性副反應(yīng)。

波形蛋白（Vimentin）是間質(zhì)細胞中最主要的中間纖維，存在于中胚層起源的細胞中，如成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、粒細胞、系膜細胞。中間纖維是真核生物細胞的重要結(jié)構(gòu)性特征，它們與微管及肌動蛋白微細絲，組成細胞骨架。TGF β可促進波形蛋白的表達上調(diào)[27]。盡管大多數(shù)中間纖維結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，但在成纖維細胞中波形蛋白以一種動態(tài)結(jié)構(gòu)存在。正常情況下，骨骼肌細胞僅表達微量的波形蛋白，在炎癥、損傷等各種因素的刺激下，間質(zhì)成纖維細胞發(fā)生功能與表型變化，轉(zhuǎn)分化為成纖維細胞和具有細胞特性的肌成纖維細胞，大量表達波形蛋白。因此許多學者將波形蛋白作為骨骼肌損傷后纖維化程度的指標[7，10，11]，波形蛋白表達越高，意味著骨骼肌損傷后纖維化程度越嚴重。本研究發(fā)現(xiàn)，Smad4 siRNA注射組波形蛋白表達較對照組明顯降低，Masson染色結(jié)果也提示，Smad4 siRNA注射后疤痕生成弱于對照組。這表明Smad4 siRNA可明顯降低骨骼肌急性鈍挫傷后的纖維化，減少疤痕產(chǎn)生。

另外，生理學檢測發(fā)現(xiàn)，急性鈍挫傷后28天，Smad4 siRNA注射組小鼠腓腸肌強直收縮和快速顫搐收縮明顯高于對照組，表明抑制骨骼肌急性鈍挫傷后的纖維化，減少疤痕生成后，可明顯改善骨骼肌的愈合質(zhì)量。

骨骼肌損傷后的再生和纖維化發(fā)生的時間不同。一般來說，傷后14天骨骼肌再生達到高峰。傷后10～14天纖維化反應(yīng)開始啟動，傷后18天反應(yīng)最明顯，并一直持續(xù)到傷后4周[28]。以往研究常在傷后1～2 周時注射抑制骨骼肌纖維化的藥物[29，30]。綜上考慮，我們于傷后第10天在損傷局部注射慢病毒液，以期避免由于病毒注射而對骨骼肌再生造成影響，而且精確調(diào)控其對纖維化的抑制作用。

4 總結(jié)

以慢病毒為載體的Smad4 siRNA可成功轉(zhuǎn)染小鼠急性鈍挫傷骨骼肌，并長期發(fā)揮抑制Smad4基因及蛋白表達的作用，同時不會遠處轉(zhuǎn)染其他臟器，是一種安全有效的方法。同時，以慢病毒為載體的Smad 4 siRNA可抑制骨骼肌損傷后纖維化，減輕疤痕生成，改善骨骼肌損傷后的愈合質(zhì)量，促進骨骼肌損傷修復(fù)。

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