萬紅娟，趙 特，董紅平，劉 希，郭朝陽，周 琳

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，河南鄭州450002;2.河南省新型農(nóng)藥創(chuàng)制與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州450002)

辣椒疫病是由辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici Leonian)引起的一種毀滅性土傳卵菌病害，現(xiàn)已在全世界普遍發(fā)生［1］.近年來，隨著辣椒在各主產(chǎn)區(qū)的連茬種植，該病害有逐漸加重的趨勢，危害較為顯著［2］.疫病可危害辣椒的根、莖、葉和果實(shí)等部位，在氣候條件適宜的情況下，短期內(nèi)就可爆發(fā)，蔓延速度極快，給辣椒生產(chǎn)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失［3］.化學(xué)合成殺菌劑通常被用來控制多種植物病害，但其不合理使用引起了諸多問題，如病原真菌對(duì)殺菌劑的抗性及食品、水、空氣和土壤中農(nóng)藥殘留的檢出等［4］.因此，從生物體特別是植物體中尋找新的高效、低毒、低殘留且與環(huán)境相容性好的天然活性物質(zhì)已成為人們努力的方向［5，6］.目前國內(nèi)外已發(fā)現(xiàn)殺菌活性植物1 400余種，其次生代謝產(chǎn)物超過40萬種，其中含有許多對(duì)病原菌有抑制作用的活性物質(zhì)［7］，且已有多個(gè)植物源殺菌劑投放市場［8］.歐亞旋覆花(Inula britannica L.)為菊科旋覆花屬草本植物，在中國、日本和朝鮮等國分布非常廣泛［9］，是一種傳統(tǒng)的中草藥，具有降氣、消痰、行水、止咳的功效［10］.研究發(fā)現(xiàn)旋覆花花序提取物對(duì)多種植物病原真菌具有較強(qiáng)的生物活性，特別是對(duì)辣椒疫霉菌菌絲生長和孢子萌發(fā)抑制作用較強(qiáng)［11，12］.為進(jìn)一步明確旋覆花的抑菌活性部位及其對(duì)辣椒疫霉菌的控制效果，本研究系統(tǒng)測試了旋覆花4個(gè)部位的不同溶劑提取物的離體抑菌活性，并進(jìn)行了盆栽藥效試驗(yàn).

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 植物樣品 2007－07于河南省鄭州市市郊采集旋覆花植株，陰干后粉碎得干粉，過40目篩，備用.

1.1.2 供試菌種 辣椒疫霉菌(P.capsici)，由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供.

1.2 旋覆花不同部位不同溶劑提取物的制備方法

采用浸漬超聲提取.取旋覆花的根、莖、葉、花粉碎樣品各50 g，分別用石油醚、乙酸乙酯、氯仿、正丁醇4種不同極性溶劑浸泡24 h后進(jìn)行室溫超聲提取20 min，過濾，得濾液.如此重復(fù)3次，合并濾液，減壓濃縮各提取液，加10 mL丙酮定容，配成質(zhì)量濃度為5.0 g·mL－1的供試藥液，置冰箱中保存?zhèn)溆?

1.3 旋覆花提取物對(duì)辣椒疫霉菌菌絲生長的影響

采用吳文君［13］的抑制菌絲生長速率法.分別取質(zhì)量濃度為5.0 g·mL－1的供試藥液 0.2 mL 加到9.8 mL PDA培養(yǎng)基中，即各提取物的供試終質(zhì)量濃度為 0.1 g·mL－1，每培養(yǎng)皿放置 1個(gè)菌餅(直徑為4 mm)，重復(fù)3次，以相應(yīng)溶劑為對(duì)照.按公式(1)評(píng)判生物測定效果.

1.4 旋覆花提取物對(duì)辣椒疫霉菌游動(dòng)孢子釋放的影響

參照畢艷紅等［14］的方法.將辣椒疫霉菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d后接種到米糠培養(yǎng)基上，在光強(qiáng)3 000 lx、光暗比12 h∶12 h，25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 d，用無菌水配成 4.0 ×106個(gè)·L－1的孢子囊懸浮液(在10×10倍顯微鏡下觀察).將供試藥液與孢子囊懸浮液等體積混勻，以無菌水與孢子囊懸浮液等體積混合液為對(duì)照.將混合液滴滿凹玻片凹面，置于培養(yǎng)皿內(nèi)保濕，在4℃冰箱中處理15 min后，移至25℃恒溫箱中培養(yǎng)5 h，取出載玻片在10×10倍顯微鏡下隨機(jī)檢查3個(gè)視野，每視野觀察約50個(gè)孢子囊，以孢子囊中游動(dòng)孢子全部游出而成空殼記錄為完全釋放，每處理3個(gè)重復(fù)，以平均值作為測定結(jié)果.按公式(2)求供試藥劑對(duì)病原菌孢子囊中游動(dòng)孢子釋放的抑制作用.

1.5 旋覆花的花提取物對(duì)辣椒疫病的盆栽防效

保護(hù)作用測定:當(dāng)盆栽辣椒長至5～8片葉時(shí)，取供試藥液5 mL在距離辣椒植株1 cm處灌根.每種藥劑設(shè)置6次重復(fù)，以自來水和50%福美雙可濕性粉劑800倍液為對(duì)照.24 h后將配好的孢子囊懸浮液5 mL在距離植株2 cm處灌根，于溫度為28℃、相對(duì)濕度為50%條件下培養(yǎng)6 d后調(diào)查病害級(jí)別［15］.治療作用測定方法同保護(hù)作用，區(qū)別是先接種辣椒疫霉菌孢子囊懸浮液24 h后再用藥劑灌根.以自來水和安博可濕性粉劑800倍液作為空白對(duì)照和標(biāo)準(zhǔn)藥劑對(duì)照.分別按公式(3)和公式(4)計(jì)算病情指數(shù)與防治效果.

1.6 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 10.0軟件中ANOVA方法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，并用Duncan’s新復(fù)極差法比較數(shù)據(jù)之間的差異顯著性.

2 結(jié)果與分析

2.1 旋覆花提取物對(duì)辣椒疫霉菌菌絲生長的抑制作用

抑制菌絲生長速率法測定結(jié)果(表1)表明，在0.1 g·mL－1供試條件下，除旋覆花莖部氯仿提取物外，同一組織的不同溶劑提取物對(duì)辣椒疫霉菌菌絲生長均有較強(qiáng)的抑制活性，其中花的抑制活性最強(qiáng)，其石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物對(duì)供試菌菌絲生長的抑制率分別為81.19%，93.15%，100%，95.43%;葉的抑制活性次之，抑制率分別為 81.17%，88.29%，95.43%，87.16%;莖的石油醚提取物、乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物的抑制率分別為65.66%，74.05%，82.76%，根的4種溶劑提取物的抑制率也均在60%以上，分別為 73.22%，62.79%，64.20%，73.61%.

表1 旋覆花不同組織不同溶劑提取物對(duì)辣椒疫霉菌菌絲生長抑制作用Table 1 Inhibition of Inula britannica extracts by various solvents on mycelium growth of Phytophthora capsici

2.2 旋覆花提取物對(duì)辣椒疫霉菌游動(dòng)孢子釋放的抑制作用

在0.05 g·mL－1供試質(zhì)量濃度下，旋覆花不同部位4種溶劑提取物對(duì)辣椒疫霉病菌孢子囊中游動(dòng)孢子釋放的抑制作用小于對(duì)菌絲生長的抑制作用.根、莖、葉、花4個(gè)不同組織中，葉的石油醚提取物對(duì)辣椒疫霉菌孢子萌發(fā)的抑制作用較強(qiáng)，抑制率為 83.33%，莖的石油醚提取物抑制率為66.67%，其它提取物對(duì)辣椒疫霉菌游動(dòng)孢子釋放的抑制作用都較弱，均低于45.56%(表2).

表2 旋覆花不同部位不同溶劑提取物對(duì)辣椒疫霉菌孢子釋放抑制作用Table 1 Inhibition of Inula britannica extracts by various solvents on spores release of Phytophthora capsici

2.3 旋覆花的花提取物對(duì)辣椒疫病的盆栽防效

盆栽試驗(yàn)結(jié)果(表3)表明，在 1.0 g·mL－1處理劑量下，旋覆花花序氯仿提取物對(duì)辣椒疫病的治療作用最強(qiáng)(52.18%)，與對(duì)照藥劑50%福美雙可濕性粉劑800倍液相比無明顯差異，其它3種溶劑提取物的治療作用均顯著低于對(duì)照藥劑.旋覆花花序氯仿提取物對(duì)辣椒疫病的保護(hù)作用亦為最強(qiáng)，防效達(dá)46.35%，與對(duì)照藥劑的防效相當(dāng)，其它3種溶劑提取物的保護(hù)作用均顯著低于對(duì)照藥劑.

表3 旋覆花的花提取物對(duì)辣椒疫霉病的盆栽防效Table 3 The efficacy of the flower extracts of Inula britannica against phytophthora blight in pepper plant

3 結(jié)論與討論

3.1 旋覆花提取物對(duì)辣椒疫霉菌具有較強(qiáng)的抑菌活性

本研究結(jié)果表明，在 0.1 g·mL－1供試條件下，旋覆花根、莖、葉、花4個(gè)部位的4種溶劑提取物能顯著抑制辣椒疫霉菌的菌絲生長，其中花和葉的4種溶劑提取物抑制率均在80%以上;除旋覆花莖的氯仿提取物外，其它莖和根的不同溶劑提取物抑制活性均在 62.79%以上.在 0.05 g·mL－1供試條件下，旋覆花莖和葉的石油醚提取物對(duì)辣椒疫霉菌游動(dòng)孢子釋放的抑制作用較強(qiáng)，抑制率分別為83.33% 和 66.67%.盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，在1.0 g·mL－1處理劑量下，旋覆花花的氯仿提取物對(duì)辣椒疫病的治療作用和保護(hù)作用與50%福美雙可濕性粉劑800倍液相當(dāng).可見，旋覆花不同部位的不同極性溶劑提取物對(duì)辣椒疫霉菌具有較強(qiáng)的控制效果，其在辣椒疫病防治上具有較大的開發(fā)應(yīng)用潛力.

3.2 旋覆花中抑菌活性成分值得進(jìn)一步分離

已有研究表明，旋覆花不同溶劑提取物對(duì)多種植物病原真菌具有較強(qiáng)的抑菌活性［11，12，16］，本研究結(jié)果表明，旋覆花各部位的不同極性溶劑提取物對(duì)辣椒疫霉菌具有不同程度的抑制活性，均說明植物體中含有一種或多種具有抑菌活性的化合物.王紅剛等［17］從歐亞旋覆花中分離出了1－氧－乙酰大花旋覆花內(nèi)酯，并發(fā)現(xiàn)其對(duì)黃瓜白粉菌、黃瓜霜霉菌、番茄早疫菌、黃瓜灰霉菌和致病疫霉均有一定的抑菌活性，其中對(duì)致病疫霉休止孢萌發(fā)抑制作用最強(qiáng)，在質(zhì)量濃度為0.1 g·L－1時(shí)，抑制率可達(dá)100%，與化學(xué)藥劑百菌清相當(dāng).因此，有必要采用不同極性溶劑對(duì)旋覆花主要抑菌活性部位——花和葉進(jìn)行萃取，并對(duì)提取物中的抑菌活性成分進(jìn)行系統(tǒng)的分離和鑒定，為旋覆花的直接開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，為尋找新型植物源殺菌劑的先導(dǎo)化合物提供重要線索.

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