熊治國，劉志剛，李建祥，裴海朝，高福玲，秦采風(fēng)，陳占寬，葉金山，付 曉

(1.河南省綠士達(dá)林業(yè)新技術(shù)研究所，河南鄭州450008;2.河南省經(jīng)濟(jì)林和林木種苗工作站，河南鄭州450008;3.國家林業(yè)局泡桐研究開發(fā)中心，河南 鄭州450003;4.新安縣林業(yè)局，河南 新安471800)

白花泡桐(Paulownia fortunei(Seem.)Hemsl.)，是一種速生優(yōu)質(zhì)用材落葉樹種，生長快，成材早，繁殖容易，材質(zhì)好，用途廣，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高.木材的材質(zhì)是由其組分纖維素、木質(zhì)素等的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及二者的總量和比率決定的［1］.尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶 (UDP-Glucose Pyrophosphorylase，UGPase)，催化葡萄糖－1－磷酸(Glc-1-P)生成尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-GLC).尿苷二磷酸葡萄糖是纖維素生物合成的基本原料與前體［2］.UGP的活性決定著木材中纖維素含量及其與木質(zhì)素的比率.目前，有些研究者已從一些植物如水稻［3］、黃芪［4］、大麥［5］、馬鈴薯［6］等中克隆了 UGPase.登錄 GenBanK的泡桐mRNA只有8個(gè)，且無一與泡桐纖維素、木質(zhì)素生物合成有關(guān).這意味著目前研究泡桐纖維素生物合成代謝的表達(dá)調(diào)控尚無基礎(chǔ)，搞清這些基因的結(jié)構(gòu)、序列是研究泡桐纖維素生物合成代謝的基礎(chǔ)與前提.本研究在對其他物種相關(guān)基因序列分析的基礎(chǔ)上，采用RT-PCR及RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)方法，克隆并分析了UGP mRNA全序列，旨在豐富白花泡桐基因資源，為植物品質(zhì)或材質(zhì)改良提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白花泡桐由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)提供.RNA提取試劑盒、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、高保真LA Taq、相關(guān)限制性核酸內(nèi)切酶等試劑從寶生物工程(大連)有限公司(TAKARA)購得.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 白花泡桐總RNA的提取 取20 cm長的生長旺盛的當(dāng)年生幼嫩白花泡桐枝條，剝?nèi)ロg皮部，用清潔刀片刮取木質(zhì)部外周形成層部分的細(xì)胞，液氮研磨成粉，加入試劑 RNAiso Reagent(TAKARA)提取總RNA.

1.2.2 UGP部分片段的獲得 (1)RT-PCR:以提取的總RNA為模板，Oligo dT為引物，使用TAKARA生產(chǎn)的反轉(zhuǎn)錄酶XL(Reverse Transcriptase XL AMV)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA.根據(jù)NCBI上發(fā)表的其他物種UGPase氨基酸的保守序列設(shè)計(jì)引物［7］BUF(5'－AARGAYGGNTGGTAYCCNCCNGG－3')和BUR(5'－GGRTTNGGDATDATYTCCATYTT－3')，cDNA為模板，TAKARA高保真Taq LA進(jìn)行RTPCR，擴(kuò)增UGP部分序列.反應(yīng)結(jié)束后于瓊脂糖凝膠中電泳檢測結(jié)果.(2)序列測定:凝膠回收試劑盒回收目的片段.回收后的PCR產(chǎn)物送寶生物工程(大連)有限公司(TAKARA)進(jìn)行序列測定.

1.2.3 UGP mRNA 5'上游未知序列的獲得 使用TAKARA出品的5'-FULL RACE kit(Code No:D315)來克隆5'上游未知序列.依據(jù)獲得的白花泡桐UGP部分編碼序列，優(yōu)選了2條特異的嵌套式PCR引物 U.5GSP1(5'－TGATTGCCTGTAAGTTGACCC－3')和 U.5GSP2(5'－GACATATTCTTTGCCCTGCGATA－3').克隆程序包括:1)泡桐總RNA的提取;2)泡桐總RNA去磷酸化處理;3)去帽子反應(yīng);4)5'RACE接頭的連接;5)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng);6)以外側(cè)的特異性引物U.5GSP1與5'RACE Outer(5'－TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT－3')引物進(jìn)行PCR反應(yīng);7)以內(nèi)側(cè)的特異性引物U.5GSP2與5’RACE Inner(5'－ CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG－3')引物進(jìn)行PCR反應(yīng).瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果.凝膠回收擴(kuò)增的片段，克隆于pMD20-T載體，轉(zhuǎn)化E.coli JM109，菌落PCR鑒定的陽性克隆送樣測序.

1.2.4 UGP mRNA 3'下游未知序列的獲得 使用TAKARA 出品的3'－FULL RACE Core Set Ver.20(Code No:D314)來克隆3'下游未知序列.依據(jù)獲得的白花泡桐UGP部分編碼序列，優(yōu)選了2條特異的嵌套式PCR引物U.3GSP1(5'－TTGTTATCGCAGGGCAAAG －3')和 U.3GSP2(5'－ACACTAGCTGATGTGAAAGGTGGT－3').具體的克隆程序包括:1)泡桐總RNA的提取;2)套式PCR反應(yīng)，先以外側(cè)的特異性引物U.3GSP1與3'RACE Outer(5'－TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT－3')引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)，再以內(nèi)側(cè)的特異性引物U.3GSP2與3'RACE Innerer(5'－CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG－3')引物進(jìn)行 PCR反應(yīng).瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果.凝膠回收擴(kuò)增的片段，克隆于pMD20－T載體，轉(zhuǎn)化 E.coli JM109，菌落PCR鑒定的陽性克隆送樣測序.

1.2.5 UGP mRNA全序列的獲得及分析 經(jīng)過以上步驟，分別獲得了UGP mRNA的部分序列、5'上游未知序列、3'下游未知序列，且3個(gè)序列互有重疊，經(jīng)Lasergene軟件拼接、分析，得到UGP mRNA全序列，提交GenBank.

2 結(jié)果與分析

2.1 白花泡桐部分序列的獲得

提取白花泡桐的總RNA，經(jīng)電泳檢測其濃度，反轉(zhuǎn)錄后以 BUF，BUR為引物，TAKARA高保真Taq LA RT-PCR，電泳結(jié)果見圖1.將此片段回收，插入pMD19-T vector、轉(zhuǎn)化，挑單菌落鑒定、測序.測序知擴(kuò)增片段長413 bp，與預(yù)期相符.以此DNA片段序列推測可編碼137個(gè)氨基酸，將其基因序列與NCBI中其它植物的UGPase進(jìn)行比對，與煙草、馬鈴薯的UGP序列同源性分別為85%，84%.因此根據(jù)相似度可以斷定此擴(kuò)增的片段即為泡桐UGP基因的部分mRNA序列.

圖1 UGP RT-PCR電泳圖Fig.1 The UGP of RT-PCR

2.2 UGP mRNA 5'上游未知序列的獲得

RACE法得到UGP mRNA 5'上游片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果.凝膠回收擴(kuò)增的片段，克隆于pMD20-T載體，轉(zhuǎn)化E.coli JM109，菌落PCR鑒定的陽性克隆送樣測序，測序結(jié)果參見圖2.序列中有效序列長777 bp.

2.3 UGP mRNA 3'下游未知序列的獲得

RACE法得到UGP mRNA 3'上游片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果.凝膠回收擴(kuò)增的片段，克隆于pMD20-T載體，轉(zhuǎn)化E.coli JM109，菌落PCR鑒定的陽性克隆送樣測序，測序結(jié)果見圖2.序列中有效序列長815 bp.

2.4 UGP mRNA全序列的獲得及分析

使用Lasergene軟件，得到UGP mRNA全序列，見圖3.UGP mRNA共1 694個(gè)堿基，CDS共1 428個(gè)堿基(112～1 539)，編碼氨基酸475(圖3).

圖2 白花泡桐UGP mRNA全序列Fig.2 The complete sequence of UGP mRNA

登陸NCBI網(wǎng)站，利用GenBank BLAST軟件對泡桐UGP全長mRNA序列分析比對的結(jié)果顯示，與煙草的同源性為84%，與馬鈴薯的同源性為83%，美洲山楊的同源性為 81%.利用 GenBank BLAST軟件對泡桐UGP酶氨基酸序列分析比對的結(jié)果顯示，與煙草相似性為89%，與美洲山楊的相似性為88%，與馬鈴薯的相似性為88%.

圖3 白花泡桐UGP氨基酸全序列Fig.3 The amino acid sequence alignment of UGP

3 討論

雖然UGP基因已從水稻、黃芪、大麥、馬鈴薯等幾種植物中克隆出來，但用BLAST比較了已知的幾種植物的UGP基因核苷酸序列，由于親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，很難找到可用來設(shè)計(jì)引物的同源性很高的核苷酸片段，只能依據(jù)UGP氨基酸保守序列，設(shè)計(jì)簡并引物，通過RT-PCR擴(kuò)增得到一段cDNA片段，以此片段序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)特異引物，再通過5'RACE擴(kuò)增得到了含5'末端的cDNA片段，3'RACE擴(kuò)增得到含3'末端的cDNA片段.根據(jù)以上2個(gè)片段的核苷酸序列，設(shè)計(jì)特異引物，擴(kuò)增得到了包含完整編碼區(qū)的全長cDNA.為提高PCR擴(kuò)增的特異性，采用嵌套PCR擴(kuò)增.由嵌套引物引導(dǎo)的第2輪PCR可顯著提高擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性.RACE是1種以PCR為基礎(chǔ)快速分離包含3'和5'末端的cDNA的方法.其優(yōu)點(diǎn)在于快速簡便，僅知少量序列信息時(shí)即可擴(kuò)增得到全長cDNA，多數(shù)情況下無需構(gòu)建cDNA文庫.我們在僅知UGP部分氨基酸序列的情況下，未構(gòu)建cDNA文庫，應(yīng)用RACE這種方法，首次得到了白花泡桐UGP全長cDNA.

對于植物UGPase是否存在多基因家族的問題，早期研究者認(rèn)為植物中只有1種UGPase，EIMERT等從大麥葉、胚及胚乳的cDNA文庫中克隆了11個(gè)UGPase序列，結(jié)果也表明大麥中只有1種UGPase［5］.但后來的研究發(fā)現(xiàn)在馬鈴薯［8，9］、水稻［3］中存在2種相似性很高的UGPase.水稻中存在2種UGPase，其中UGP1位于第9條染色體上，而UGP2位于第2條染色體上.而白花泡桐中是否也存在2種UGPase，還有待進(jìn)一步研究.

本研究首次克隆了白花泡桐UGP mRNA全序列，構(gòu)建載體的后續(xù)工作正在進(jìn)行中.希望通過抑制纖維素生物合成的關(guān)鍵酶UGPASE的活性，以此提高木質(zhì)素的比率，從而提高泡桐木材的硬度.

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