鄧先余，鄒謀勇，黃志堅，易 俗,

(1.湖南科技大學生命科學學院，湖南 湘潭 411201;2.中山大學生命科學學院，廣東 廣州 510275)

纖維素是地球上光合作用產(chǎn)量最高的多糖，它是由葡萄糖以β-1,4糖苷鍵連接而成的線狀大分子物質(zhì)[1-2]。據(jù)報道，纖維素全球年產(chǎn)量為1.5×106萬t。高效纖維素酶的研究開發(fā)是可再生性資源利用的關鍵，對解決工農(nóng)業(yè)原料、能源、環(huán)境等問題十分重要[3-4]。纖維素酶是使纖維素降解生成葡萄糖的一組酶的總稱，主要包括 C1酶、CX酶和β-葡萄糖苷酶，它是降解植物纖維素酶的關鍵酶類[5]。

目前研究較多的是霉菌，其中木霉、青霉、曲霉和根霉均具有較強的酶活力，尤以綠色木霉、里氏木霉和康氏木霉為典型[6-7]；而對細菌的研究很少有報道。由細菌所產(chǎn)生的纖維素酶一般最適 pH為中性至偏堿性。近年來，隨著中性纖維素酶和堿性纖維素酶在棉織品水洗整理工藝及洗滌劑工業(yè)中的成功應用，細菌纖維素酶制劑已顯示出良好的應用前景[8]。近年來，國內(nèi)外學者在產(chǎn)纖維素酶細菌的篩選、工程菌構建方面做了大量的工作，篩選到了多種產(chǎn)纖維素酶細菌。徐慶強等[9]從海洋環(huán)境中選到的產(chǎn)堿性纖維素酶菌株 QM11，經(jīng)分子鑒定為噬纖維菌屬細菌Cytophagafucicola。呂靜琳等[10]對從腐爛朽木及其附近土壤中分離篩選到一株蠟狀芽孢桿菌。并對其發(fā)酵條件進行了優(yōu)化。Cantwell B A等[11]克隆了枯草芽孢桿菌的β-葡萄糖苷酶基因，并在大腸桿菌中進行了表達。Kotchoni OS等[12]對短小芽胞桿菌Bacilluspumilus進行了產(chǎn)纖維素酶研究，認為B.pumilus是一種抗分解代謝物抑制的良好菌株。

本文報道了一株產(chǎn)纖維素酶細菌篩選與鑒定，并對該菌株生長、產(chǎn)酶特性和所產(chǎn)纖維素酶的酶學性質(zhì)進行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 湖南科技大學校園腐爛木芙蓉根部土壤。

1.1.2 培養(yǎng)基 有機氮分離培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉CMC-Na 10 g；胰蛋白胨 5 g；KH2PO41.5 g；MgSO4·7H2O 0.2 g；CaCl20.3 g；NaCl 5 g；小牛浸膏 2.0 g；瓊脂粉 15 g；蒸餾水1 000 mL；PH 7.0。

無機氮分離培養(yǎng)基：CMC-Na 10 g；(NH4)2SO42 g；KH2PO41.5 g；MgSO4·7H2O 0.2 g；CaCl20.3 g；NaCl 5 g；小牛浸膏 2.0 g；瓊脂粉 15 g；蒸餾水1 000 mL；PH 7.0。

有機氮發(fā)酵培養(yǎng)基：(CMC-Na)8 g；葡萄糖 2 g；胰蛋白胨 5 g；KH2PO41.5 g；MgSO4·7H2O 0.2 g；CaCl20.3 g；NaCl 5 g；小牛浸膏 2.0 g；蒸餾水1 000 mL；PH 7.0。

無機氮發(fā)酵培養(yǎng)基：CMC-Na 8 g；葡萄糖2 g；(NH4)2SO42 g；KH2PO41.5 g；MgSO4·7H2O 0.2 g；CaCl20.3 g；NaCl 5 g；小牛浸膏 2.0 g；蒸餾水1 000 mL；PH 7.0。

1.1.3 試劑 剛果紅，2,4-二硝基水楊酸(DNS)，葡萄糖等常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。CTAB、溶菌酶、蛋白酶K、SDS等均購自Sigma公司。Taq酶、PCR產(chǎn)物回收試劑盒購自上海生工，PCR引物由上海生工合成。Tiangen細菌基因組總DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品預處理 取采集到的土壤樣品5 g 于一個滅菌的潔凈三角瓶，加已滅菌的w=7.5% NaCl溶液10 mL，充分振蕩后，37 ℃，180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)1 h。取500 μL培養(yǎng)液于1.5 mL EP管中，2 000 r/min離心5 min,取上清4 ℃冷藏待用。

1.2.2 目標菌株的分離與篩選 取上述上清液200 μL分別涂布于有機氮分離培養(yǎng)基，同時以無碳培養(yǎng)基作為對照，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取生長狀況較好的菌落進一步劃線培養(yǎng)。重復劃線數(shù)次后，用w=0.1%剛果紅溶液染色5 min，1 mol/L NaCl溶液洗滌，自來水洗滌至洗出液無色。選取水解圈較大的菌株，并命名為CXB001，接種至有機氮分離培養(yǎng)基斜面，37 ℃培養(yǎng)36 h 后4 ℃冷藏保種。

1.2.3 菌落形態(tài)觀察與鏡檢 取CXB001斜面菌種，分別接種于有機氮分離培養(yǎng)基和無機氮分離培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h后，觀察并記錄菌落生長狀況和菌落形態(tài)。挑取少量菌體進行芽孢染色，并與油鏡下觀察并記錄菌體形態(tài)。然后同上法進行剛果紅染色，比較水解圈的大小。

1.2.4 生理生化測試 參考東秀珠[13]等《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》對CXB001菌株進行生理生化測試。

1.2.5 CXB001總DNA的提取 采用天根細菌基因組總DNA提取試劑盒提取CXB001菌株總DNA。作為CXB001 16S rDNA PCR擴增的模板。

1.2.6 16S rDNA 的PCR擴增與測序 以提取的總CXB001的基因組總DNA為底物，以F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACG-3′為正向引物，R: 5′-TACGG- CTACCTTGTTACGACTTCACCC -3′為反向引物對CXB001菌株進行16S rDNA進行擴增。PCR擴增反應體系為：底物DNA 模板1 μL(約10 ng),DNA聚合酶 Taq 酶1.5 單位，引物F 和R 各1 μL(約25 pmol/L)，dNTP：5 mol/L dNTP 2 μL，buffer：10×緩沖液(含15 mol/L MgCl2) 5 μL，去離子水：加ddH2O 至50 μL。擴增反應程序： 94 ℃ 5 min，然后94 ℃ 1 min，55 ℃ 45 S，72 ℃ 1.5 min 共30 個循環(huán),再72 ℃ 10 min。反應完畢分別取6 μL 進行w=0.8%瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像系統(tǒng)下分析結果。PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)DNA純化試劑盒(上海生工公司)純化后,直接送南京金斯瑞生物科技有限公司進行DNA 測序。

1.2.7 CXB001分子系統(tǒng)進化樹的構建 利用BLAST 在線同源性查詢軟件查詢所測菌株CX001的16S rDNA 序列的屬性,將其與從GenBank 數(shù)據(jù)庫中獲得的芽孢桿菌屬細菌及其他親緣關系相近的屬種的16S rDNA,采用Clustal W1.8 軟件進行多序列匹配排列(Multiple Alignments),用系統(tǒng)發(fā)生推斷軟件包MEGA 3.1 進行系統(tǒng)發(fā)育分析。在Kimura-2-parameter模型的基礎上,用Neighbor-joining 法構建分子系統(tǒng)樹,自舉分析(Bootstrap)1 000 次重復檢測分子系統(tǒng)樹的置信度,缺失和不確定的位點在計算中被省略。

1.2.8 PH 耐受性實驗 將CXB001斜面菌種分別接種于pH值梯度為5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，12.0的無機氮發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min搖床培養(yǎng)5 d，取菌液于650 nm處測定吸光度。間接反映菌株的pH耐受性。并取初酶液測CMC酶活力。

1.2.9 溫度耐受性實驗 將CXB001斜面菌種分別接種無機氮發(fā)酵培養(yǎng)基中，于溫度梯度為28，31，34，37，41 ℃下180 r/min搖床培養(yǎng)5 d，取菌液650 nm處測定吸光度。間接反映菌株的溫度耐受性。并取初酶液測CMC酶活力。

1.2.10 酶學特性分析

1) 制作葡萄糖標準曲線:取10 支20 mL 具塞刻度試管，并編號，按表1 分別加入質(zhì)量濃度為1 mg/mL的葡萄糖標準液、蒸餾水和3,5-二硝基水楊酸(DNS)試劑，配成不同葡萄糖含量的反應液。

表1 葡萄糖標準曲線制作參數(shù)

將各管搖勻，在沸水浴中準確加熱5 min，取出，冷卻至室溫，用蒸餾水定容至20 mL，加塞后顛倒混勻，在分光光度計上進行比色。調(diào)波長540 nm，用0號管調(diào)零點，測出1- 6號管的光密度值。以光密度值為縱坐標，葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標，繪出標準曲線。結果如圖1所示。

圖1 葡萄糖標準曲線

2) CMC酶活的測定[14-15]：每個菌株取4 mL 發(fā)酵液,6 000 r/min 離心10 min,取上清液則為粗酶液。在25 mL 刻度試管中先加入1.5 mLw=1%CMC 溶液,再加入0.5 mL粗酶液,搖勻。滅活對照,在25 mL刻度試管中加入1.5 mLw=1%CMC-Na 溶液。再加入0.5 mL滅活的粗酶液(將粗酶液在沸水浴中加熱5 min制得),搖勻。樣品與滅活對照同時放入(50 ±1) ℃水浴中保溫反應1 h 后,立即加入1.5 mL DNS 試劑。之后將各樣品及空白對照同時放入沸水浴中反應5 min,取出后立即置于冰水中冷卻至室溫。酶活力單位的定義: 在一定的反應條件下( pH 值、溫度),每小時由底物生成1 μmol葡萄糖所需的酶量定義為1個酶活力單位(U) 。通過研究不同pH值、溫度條件及金屬離子對酶活的影響,對該菌產(chǎn)的CMC酶學性質(zhì)進行分析。

3) 酶活計算公式：酶活性[U/(μmol·h)]= 1 000nC/MT式中,C為反應后待測液中的葡萄糖含量(mg);M為葡萄糖的摩爾質(zhì)量(180 g/mol);n為酶液的稀釋倍數(shù);T為水解時間(1 h)。

3 結 果

3.1 CXB001生理生化特性

常規(guī)生理生化測試表明，菌株CXB001為革蘭氏陽性，具芽孢。菌落為米白色，邊緣不光滑且不完整，表面有皺褶，菌落不透明。好氧，化能異養(yǎng)。接觸酶陽性，V-P測定為陽性，還原硝酸鹽。能水解明膠、淀粉，能利用檸檬酸鹽、丙酸鹽。利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇產(chǎn)酸。w=7% NaCl，40 ℃正常生長。根據(jù)這些特征，初步判斷該株菌為芽孢桿菌屬Bacillus細菌。

3.2 CXB001 16S rDNA測序結果與系統(tǒng)進化樹構建

為進一步確定居住CXB001的分類地位，測定了其16S rDNA 序列，所獲得的16S rDNA 序列長度為1 423 bp。圖2列出了CXB001的16S rDNA序列。

圖2 CXB001菌株的16S rDNA 序列

Fig.2 The sequence of 16S rDNA of strain CXB001

將CXB001 16S rDNA在NCBI中進行同源性檢索，發(fā)現(xiàn)CXB001與芽孢桿菌屬16S rDNA序列自然聚類。在相似性最高的100個序列中芽孢桿菌占95%，CXB001與它們的同源性為99%～100%；從100個序列中挑取7個已經(jīng)鑒定到種的菌株的的16S rDNA進行分子系統(tǒng)發(fā)育樹分析，結果如圖3所示。CXB001與Bacillusvelezensis聚成一枝，兩者的遺傳距離為0.000 17。序列相似性99.9%。

圖3 菌株CXB001的16S rDNA 系統(tǒng)進化樹分析結果

Fig.3 The molecular phylogenetic tree of CX001 based on 16S rDNA sequence

(圖中括弧中的序列號為對應菌種的在NCBI中16S rDNA的登錄號)

3.3 培養(yǎng)條件對CXB001生長速率和產(chǎn)酶量的影響

3.3.1 發(fā)酵時間對CXB001生長速率和產(chǎn)酶量的影響 在接種后12，24，36，48，60，72，84，96，108，120，132，144 h測定菌液650 nm吸光度和粗酶液的CMC酶活力，結果如圖4所示?？芍囵B(yǎng)120 h后CXB001生長速率增加，生長產(chǎn)酶量達到3.423 U/mL，為纖維素酶的最佳收獲期。

3.3.2 初始pH對CXB001生長速率和產(chǎn)酶量的影響 分別在初始pH 5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，12.0的無機氮發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d，測定菌液650 nm吸光度和粗酶液的CMC酶活，結果如圖5所示。表明CXB001在pH 6.0～9.0產(chǎn)酶量較高，在pH 5.0～11.0均能生長，最適生長pH 為7.0。

圖5 初始pH對CXB001生長和產(chǎn)酶的影響

3.3.3 溫度對CXB001生長速率和產(chǎn)酶量的影響

在28，31，34，37，40，43 ℃下，培養(yǎng)5 d測定菌液650 nm吸光度和粗酶液的CMC酶活，結果如圖6所示。表明CXB001在34～40 ℃具有較高產(chǎn)酶量，最高達到最適生長溫度為34～37 ℃，隨著溫度升高產(chǎn)酶量和生長速率均受到抑制。

圖6 溫度對CXB001生長和產(chǎn)酶的影響

3.3.4 鹽度對CXB001生長速率和產(chǎn)酶量的影響

分別在鹽度為0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%，3.5%，4.0%，4.5%，5.0%，5.5%，6.0%，6.5%，7.0%，10.0%的無機氮發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d，測定菌液650 nm吸光度和粗酶液的CMC酶活，結果如圖7 所示。表明CXB001在1.5%～3.5%NaCl條件下產(chǎn)酶量較高，NaCl濃度大于4.0%時產(chǎn)酶量急劇降低；1.5%～6.0% NaCl 條件下生長速率穩(wěn)定，即CXB001具有較高的耐鹽能力。

圖7 鹽度對CXB001生長和產(chǎn)酶的影響

3.4 酶學特性分析

3.4.1 pH對纖維素酶活力和穩(wěn)定性的影響 分別在pH 3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，1% CMC溶液中測定初酶液的CMC酶活力；將初酶液分別置于pH 3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中，1 h后測定CMC酶活力。結果如圖8所示。表明CXB001所產(chǎn)的纖維素酶的最適pH在5.0左右，在pH 5.0 ～7.0具有較高穩(wěn)定性。

圖8 pH對纖維素酶活力和穩(wěn)定性的影響

3.4.2 溫度對纖維素酶活力和穩(wěn)定性的影響 分別在20，30，40，50，60，70，80 ℃下，測定初酶液的CMC酶活力；將初酶液分別置于20，30，40，50，60，70，80 ℃水浴鍋中，1 h后測定CMC酶活力。結果如圖9示。表明在50 ℃左右為酶的最適溫度，在低溫時該酶具有較高穩(wěn)定性，隨著溫度的升高酶的穩(wěn)定性逐漸降低。

3.4.3 金屬離子對纖維素酶活力的影響 在纖維素酶反應底物中分別添加Fe2+，Ca2+，K+，Co2+，Mg2+，測定CMC酶活力，結果如圖10所示。表明Co2+對CXB001所產(chǎn)纖維素酶具有激活作用，K+和Ca2+對CXB001所產(chǎn)纖維素酶作用不顯著，F(xiàn)e2+和Mg2+對CXB001所產(chǎn)纖維素酶具有抑制作用。

圖9 溫度對纖維素酶活力和穩(wěn)定性的影響

圖10 金屬離子對纖維素酶活力的影響

4 討 論

纖維素酶是當今微生物界和酶學界的一個研究熱點，近年來，科學家們非常注重高產(chǎn)纖維素酶菌種分離篩選。目前主要的研究方向為霉菌，其中木霉、青霉、曲霉和根霉均具有較強的產(chǎn)纖維素酶能力，尤以綠色木霉、里氏木霉和康氏木霉更為突出。Mathesh 等[16]對6種木霉進行了發(fā)酵產(chǎn)酶研究，發(fā)現(xiàn)Trichodrmacitrinoviride為最高效的纖維素酶產(chǎn)生菌株。Qin等[17]從土壤中分離了一株高產(chǎn)纖維素酶真菌Fusariumchlamydosprum,對其進行了分子鑒定和酶學特性研究。目前對其纖維素酶系統(tǒng)研究的比較多的人工分離純化的能降解纖維素的細菌主要有瘤胃厭氧細菌白色瘤胃球菌Ruminococcusalbus、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌Fibrobactersuccinogenes、堆肥厭氧細菌熱纖梭菌Clostridiumthermocellum、解纖維梭菌Clostridiumcellulolyticum、土壤好氧細菌糞肥纖維單胞菌Cellulomonasfimi、混合纖維弧菌Cellvibriomixtus[18- 21]、蠟狀芽孢桿菌[10]等，在國內(nèi)，枯草芽孢桿菌[22]，噬纖維菌屬[9]等均有大量報道。

本文從湖南科技大學校園腐爛木芙蓉根部土壤中分離了一株產(chǎn)纖維素酶菌株CXB001，該菌株能以CMC-Na為唯一碳源和能源生長，剛果紅染色后有明顯的透明圈。常規(guī)生理生化測試結果表明菌株CXB001為革蘭氏陽性，芽孢橢圓。菌落為米白色，邊緣不光滑且不完整，表面有皺褶，菌落不透明。好氧，化能異養(yǎng)。接觸酶陽性，V-P測定為陽性。還原硝酸鹽。能水解明膠、淀粉，能利用檸檬酸鹽、丙酸鹽。利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇產(chǎn)酸。w=7% NaCl，40 ℃正常生長。根據(jù)這些特征，與芽孢桿菌屬Bacillus細菌的表型特性相似。從16S rDNA序列的相似性和分子系統(tǒng)進化樹上看，CXB001與B.velezensis聚成一分枝，具有較高(99.9%)的序列同源性，表明CXB001與B.velezensis的親緣關系最為接近。綜上所述，從生理生化、16S rDNA基因序列同源性、系統(tǒng)發(fā)育樹等方面分析，菌株CXB001可鑒定為B.velezensis。

目前針對B.velezensis的研究主要是將其作為生物防治的益生菌資源[23-25]。王偉等[23]發(fā)現(xiàn)B.velezensis對于番茄灰霉病具有一定的拮抗作用。王世英等[24]以健康仔豬的糞便為試樣，獲得了對腹瀉病原菌有拮抗作用的益生菌B.velezensis。田祖光[25]從棉花根際土壤中分離到了一株對大麗輪枝菌有拮抗活性的菌株，將其鑒定為B.velezensis，并對其進行了培養(yǎng)條件優(yōu)化。Amit Bafana等[26]報道了一株B.velezensis具有解Direct Red 28 (DR28)的能力，并分離了其偶氮還原酶(60 000)，研究了其對偶氮染料的解毒能力。Liu等[27]從海洋環(huán)境中分離了一株B.velezensis，發(fā)現(xiàn)其具有生物表面活性和廣泛的抗菌特性，其表面活性可以產(chǎn)生生物乳化劑。國內(nèi)外對于B.velezensis產(chǎn)纖維素酶活力的研究較少報道，僅有金迪等[28]從吉首旗幟山松樹林土壤中分離獲得1株高活性纖維素降解細菌B.velezensis；對其產(chǎn)酶條件研究表明：產(chǎn)酶產(chǎn)纖維素酶最佳培養(yǎng)溫度、最適初始 pH和培養(yǎng)時間分別為 28 ℃，7.0～7 .5和32 h。

對CXB001菌株的生物特性研究表明，其最適生長溫度為37 ℃，在10～50 ℃，pH 5.0～ 11.0；w為1.5% ～6.0% NaCl 條件下中均能生長，可知 CXB001具有較高溫度適應性，較強的耐酸堿和耐鹽能力。在pH 6.0～9.0，34～40 ℃，w為1.5%～3.5% NaCl 的培養(yǎng)條件下，最適產(chǎn)纖維素酶。CXB001所產(chǎn)纖維素酶最適反應溫度為50 ℃，最適反應pH為5.0，可知該酶為中溫酸性酶；在20 ℃、pH 5.0～7.0具有較好的穩(wěn)定性。Co2+對纖維素酶具有激活作用，Mg2+，F(xiàn)e2+對纖維素酶具有抑制作用。CXB001菌株在沒有進行發(fā)酵條件優(yōu)化時，最高酶活力達到3.42 U/mL，是進行誘變育種、纖維素酶基因克隆的良好出發(fā)菌株，有望被改良構建成為高效產(chǎn)纖維素酶的工程菌株。

致謝：湖南科技大學生命科學學院的周定港、王立立、楊惠、歐俊、呂芳彪等同學在實驗過程中給予幫助，在此表示感謝。

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