陳文剛，陳建權(quán)，劉建平，榮英蕊，郎曉猛

（1.河北省玉田縣醫(yī)院內(nèi)二科，河北玉田 064100；2.河北省中醫(yī)院消化內(nèi)科，河北石家莊 050011；3.河北醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，河北石家莊 050011）

泄?jié)峤舛痉綄?duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織TLR4/NF-κB信號(hào)通路的影響

陳文剛1，陳建權(quán)1，劉建平2*，榮英蕊3，郎曉猛3

（1.河北省玉田縣醫(yī)院內(nèi)二科，河北玉田 064100；2.河北省中醫(yī)院消化內(nèi)科，河北石家莊 050011；3.河北醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，河北石家莊 050011）

目的觀察泄?jié)峤舛痉綄?duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織Toll樣受體4（toll like receptor 4，TLR4）/核因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）信號(hào)通路的影響。方法2，4，6-三硝基苯磺酸/乙醇混合溶液灌腸復(fù)制潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型。設(shè)正常組、模型組、柳氮磺胺吡啶組、泄?jié)峤舛痉叫┝拷M、泄?jié)峤舛痉酱髣┝拷M；觀察大鼠結(jié)腸組織TLR4及NF-κB表達(dá)。結(jié)果與模型組、柳氮磺胺吡啶組、泄?jié)峤舛痉叫┝拷M相比，泄?jié)峤舛痉酱髣┝拷MTLR4mRNA及NF-κB的表達(dá)均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論泄?jié)峤舛痉娇擅黠@減少潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織TLR4及NF-κB表達(dá)，這可能是其對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎治療作用的機(jī)制之一。

結(jié)腸炎，潰瘍性；泄?jié)峤舛痉剑淮笫?/p>

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerativecolitis，UC）是一種原因不明的慢性非特異性炎癥性腸病。多認(rèn)為UC發(fā)病與免疫反應(yīng)的異常有關(guān)，Toll樣受體4（toll like receptor 4，TLR4）/核因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）信號(hào)通路在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著極其重要的作用［1］。泄?jié)峤舛痉綖楣P者課題組臨床實(shí)踐中篩選出的治療潰瘍性結(jié)腸炎的有效方劑，為進(jìn)一步探討泄?jié)峤舛痉矫庖哒{(diào)節(jié)作用機(jī)制，我們復(fù)制了2，4，6-三硝基苯磺酸/乙醇大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型，并在此模型上觀察泄?jié)峤舛痉綄?duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織TLR4/NF-κB信號(hào)通路的影響并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康成年雄性SD大鼠45只，體質(zhì)量200～220g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；動(dòng)物等級(jí)，一級(jí)；合格證712101。

1.2 藥品與試劑：傳統(tǒng)泄?jié)峤舛痉剑~腥草20g、敗醬草18g、紅藤15g、葛根12g、車前子12g、黃連6g、黃芩6g、薏苡仁12g、木香3g等）為中藥復(fù)方，每毫升原液含生藥2.0g（成人1.45g·d-1·kg-1），由河北省中醫(yī)院制劑室提供。泄?jié)峤舛痉叫┝亢痛髣┝浚?.0g/kg、20.0g/kg）分別相當(dāng)于臨床成人日用量的3.5和14倍。柳氮磺胺吡啶（salazosulfamide，SASP，上海三維制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)200609C15）；2，4，6-三硝基苯磺酸、焦碳酸二乙酯（購自Sigma公司）；RT Reagents、PCR Reagents、DNA Marker（購自TaKaRa公司）；Trizol（購自nvitrogen公司）；一抗TLR4、SP免疫組織化學(xué)染色試劑盒、DAB染色試劑盒，均為北京博奧森生物工程開發(fā)有限公司產(chǎn)品。均按試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

1.3 模型制備：參考文獻(xiàn)［1-2］應(yīng)用2，4，6-三硝基苯磺酸/乙醇方法制備大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型。實(shí)驗(yàn)前禁食24h，自由飲水，在乙醚麻醉下，用直徑2mm的硅膠軟管輕插至結(jié)腸8cm處，推入含30mg 2，4，6-三硝基苯磺酸的30%乙醇溶液，每只大鼠約0.5mL，捏緊肛門倒置10min即可。3d后，隨機(jī)抽取5只模型組大鼠處死，取其結(jié)腸標(biāo)本，病理檢查確認(rèn)有充血、水腫及典型潰瘍形成等一系列病理變化即為造模成功。

1.4 分組及給藥：按隨機(jī)數(shù)字表法將40只大鼠隨機(jī)分為5組。模型組8只，正常組8只，生理鹽水2mL灌胃；泄?jié)峤舛痉叫┝拷M8只，5.0g/kg中藥灌胃；泄?jié)峤舛痉酱髣┝拷M8只，20.0g/kg中藥灌胃；柳氮磺胺吡啶組8只，0.50g/kg灌胃。共14d。

1.5 操作方法：造模后第14天，2%烏巴比妥鈉腹腔麻醉（3mL/kg），解剖大鼠，沿矢狀線正中切開，留取距肛門以上8cm處結(jié)腸標(biāo)本，沿腸系膜緣剪開腸腔，用冷生理鹽水沖洗腸內(nèi)容物，迅速取部分結(jié)腸組織置于-70℃的液氮罐中，留做TLR4 mRNA，另取部分結(jié)腸組織，做免疫組織化學(xué)。

1.6 免疫組織化學(xué)染色（SP法）檢測NF-κB表達(dá)：NF-κB p65陽性細(xì)胞主要為黏膜細(xì)胞、單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞，陽性細(xì)胞胞質(zhì)和胞核內(nèi)均有棕色顆粒，以胞核為主。采用圖象分析技術(shù)，計(jì)數(shù)鏡下單位面積（1mm×1mm）內(nèi)的平均陽性細(xì)胞數(shù)量；根據(jù)參考文獻(xiàn)［3］的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)法評(píng)估染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)量分級(jí)，在40倍高倍鏡下選取典型視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，其中陽性細(xì)胞數(shù)作為NF-κB p65計(jì)數(shù)值，并以百分率表示。

1.7 結(jié)腸組織TLR4 mRNA的表達(dá)：取組織100mg左右，放入勻漿器內(nèi)，加入適量的Trizol用勻漿器勻漿，直至勻漿液呈無顆粒透明狀，然后轉(zhuǎn)移至新的離心管中，室溫靜置5min，4℃12 000r/min離心5min，小心吸取上清液于另一離心管，加入1/5體積的氯仿，震蕩混勻后室溫靜置5min，4℃12 000r/min離心15min。轉(zhuǎn)移上層水相到另一新離心管中，加入等體積的異丙醇，充分混勻后室溫靜置10min，然后4℃12 000r/min離心10min，RNA形成白色的小團(tuán)沉淀在離心管的底部和側(cè)面，棄上清，加入75%乙醇1m L，4℃12 000r/min離心5min，盡量棄上清，漂洗2～3次RNA沉淀。最后，在無菌工作臺(tái)中干燥RNA沉淀5～10min，加入焦碳酸二乙酯處理的50μL雙蒸餾水，55℃～60℃溫育10min使RNA充分溶解，取少許溶解的RNA，用TE Buffer稀釋后于紫外分光光度計(jì)260和280nm處讀取A值，A260/ A280=1.8～2.0間方可使用，總RNA濃度= A260×稀釋倍數(shù)×0.04（g/L），用前調(diào)整為1g/L。

1.7.1 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：取總RNA 2μg，加入逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系（含AMV Buffer，dNTPs，Oligo dT Pri-mer，AMV，Rnase Inhibitor等）管中，并用DEPC處理水補(bǔ)足到50μL反應(yīng)液體積，振蕩混勻后短暫離心，加少許礦物油于PCR儀42℃30min（cDNA合成），99℃5min（逆轉(zhuǎn)錄酶失活），5℃5min。-20℃保存?zhèn)溆谩?.7.2 PCR反應(yīng)

1.7.2.1 PCR擴(kuò)增引物：引物由北京塞百盛基因技術(shù)有限公司合成。Rat TLR4，退火溫度為55℃，上游引物，5′-GTGGGTCAAGGACCAGAAAA-3′；下游引物，5′-GAAACTGCCATGTCTGAGCA-3′；擴(kuò)增片段為526bp，Rat GAPDH，退火溫度為52℃，上游引物，5′-CACCATGGAGAAGGCCGGGG-3′；下游引物，5′-GACGGACACATTGGGGGTAG-3′；擴(kuò)增片段為408bp。

1.7.2.2 PCR反應(yīng)體系：反應(yīng)體系含Taq DNA聚合酶，dNTPs，上樣染料，穩(wěn)定劑，優(yōu)化劑，反應(yīng)緩沖液，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物，上下游引物等。振蕩混勻后短暫離心，加少許礦物油于PCR儀擴(kuò)增。

1.7.2.3 PCR反應(yīng)條件：PCR擴(kuò)增條件，94℃變性3min；94℃40s，各自的退火溫度50s，72℃90s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

1.7.3 半定量分析：取每個(gè)標(biāo)本的擴(kuò)增產(chǎn)物6μL于1%含GV核酸染料的瓊脂糖凝膠電泳，以DNA Marker（DL2000）作為標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)記，電泳后于紫外透射儀觀察，并用數(shù)碼相機(jī)照相，輸入微機(jī)應(yīng)用法國VL公司BIO-PROFIF凝膠圖象分析系統(tǒng)對(duì)目的電泳條帶進(jìn)行分析，以相應(yīng)的內(nèi)參電泳條帶作為參照，結(jié)果以兩者之積分吸光度的比值表示。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 泄?jié)峤舛痉綄?duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠NF-κB p65的影響：與正常組相比，模型組NF-κB p65表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組相比，泄?jié)峤舛痉叫┝拷M、泄?jié)峤舛痉酱髣┝拷M、柳氮磺吡啶組NF-κB p65表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與柳氮磺吡啶組相比，泄?jié)峤舛痉酱髣┝拷MNF-κB p65表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），泄?jié)峤舛痉叫┝拷M表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與泄?jié)峤舛痉叫┝拷M相比，泄?jié)峤舛痉酱髣┝拷M核因子-κB p65表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表1 大鼠結(jié)腸組織NF-κB的表達(dá)

2.2 泄?jié)峤舛痉綄?duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠TLR4mRNA表達(dá)的影響：與正常組相比，模型組TLR4mRNA表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組相比，柳氮磺胺吡啶組、泄?jié)峤舛痉礁鹘MTLR4mRNA表達(dá)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與柳氮磺胺吡啶組相比，泄?jié)峤舛痉酱髣┝拷MTLR4mRN的表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），泄?jié)峤舛痉叫┝拷M表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。泄?jié)峤舛痉酱髣┝拷MTLR4蛋白水平的表達(dá)低于泄?jié)峤舛痉叫┝拷M，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表2。

表2 大鼠結(jié)腸組織TLR4m RNA表達(dá)

3 討 論

NF-κB在免疫及炎癥反應(yīng)方面起著重要作用，有功能活性的NF-κB二聚體大都含p65亞單位，這樣的二聚體具有顯著的促炎活性［4］。TLR4是免疫系統(tǒng)中的跨膜受體，其介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了UC的發(fā)生發(fā)展。TLR4通過Toll/IL-1R同源結(jié)構(gòu)域（Toll/ILIR domain，TIR）與其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，如髓樣分化蛋白88（mye-loid differentiation factor88，MyD88）、白細(xì)胞介素-1相關(guān)蛋白激酶、腫瘤壞死因子受體活化因子6（tumornecrosis factorreceptor-associated factor 6，TRAF6）和β-轉(zhuǎn)化生長因子激活的蛋白激酶（transforming growth factor-βactivatedkinase，TAK1）等相互作用，可促進(jìn)下游NF-кB抑制蛋白激酶（inhibitorkinase of NF-кB，IKK）的2個(gè)亞型IKK-α和IKK-β的活化，最終使NF-κB轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)并活化；二是通過進(jìn)化保守信號(hào)媒介（evolutionarily con-TRIF），TRIF通過N末端結(jié)合結(jié)構(gòu)域與TRAF6結(jié)合，隨后激活I(lǐng)KK復(fù)合體，使NF-κB抑制蛋白活化，最終導(dǎo)致NF-κB釋放入核，最終引起腸黏膜的炎癥反應(yīng)［5］。張弛等［6］以LPS刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，TLR4表達(dá)上調(diào)同時(shí)NF-κB p65活性增加。程方平等［7］研究發(fā)現(xiàn)甘露消毒丹對(duì)溫病濕熱證大鼠肝巨噬細(xì)胞TLR4mRNA及NF-κB p65表達(dá)具有較好的干預(yù)調(diào)控作用，能中止炎癥介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄，限制急性炎癥反應(yīng)。

泄?jié)峤舛痉接婶~腥草、車前子、紅藤、敗醬草、半夏、黃連、黃芩、葛根、生薏苡仁、木香組成，可明顯升高結(jié)腸黏膜CD+8含量，降低結(jié)腸黏膜CD+4的水平，使CD+

4/CD+8的比值保持一定比例，具有良好的免疫調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果表明，與空白組相比，模型組NF-κB p65及TLR4mRNA均表達(dá)明顯升高，柳氮磺胺吡啶組及泄?jié)峤舛痉礁鹘MNF-κB p65及TLR4mRNA表達(dá)均降低，泄?jié)峤舛痉礁鹘M及柳氮磺胺吡啶組均可降低TLR4mRNA水平的表達(dá)及NF-κBp65蛋白水平的表達(dá)，尤其是泄?jié)峤舛痉酱髣┝拷M對(duì)TLR4mRNA及NF-κB p65的下調(diào)作用更為明顯。因此，泄?jié)峤舛痉街委煗冃越Y(jié)腸炎可能是通過降低TLR4mRNA轉(zhuǎn)錄水平，使TLR4蛋白合成、表達(dá)減少，阻斷TLR4/NF-κB信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，減少促炎因子釋放，抑制免疫系統(tǒng)的過度激活，糾正潰瘍性結(jié)腸炎異常的免疫炎癥反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)的。

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（本文編輯：趙麗潔）

R574.62

B

1007-3205（2011）07-0803-03

2011-09-21；

2011-11-04

國家中醫(yī)藥管理局濁毒實(shí)驗(yàn)室資助項(xiàng)目（ZD200812-12）

陳文剛（1977-），男，河北玉田人，河北省玉田縣醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)學(xué)士，從事消化內(nèi)科疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail：Liujianping0311@yahoo.com.cn

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.07.021