黃正國，謝忠羅，黃旭峰，何 煒，金飛燕，邵成良

（浙江省富陽市人民醫(yī)院兒科，浙江富陽311400）

IL-6、CRP和CD11b在新生兒敗血癥早期診斷中的臨床價值

黃正國，謝忠羅，黃旭峰，何 煒，金飛燕，邵成良

（浙江省富陽市人民醫(yī)院兒科，浙江富陽311400）

目的探討白細胞介素-6（inter1eukin-6，IL-6）、C反應蛋白（C-reactive protein，CRP）和中性粒細胞黏附分子（CD11b）聯(lián)合檢測在新生兒敗血癥早期中的臨床診斷價值。方法回顧性分析2010年1—8月出生的新生兒196例，其中敗血癥36例，無感染（未患敗血癥）160例。分別檢測敗血癥和無感染新生兒血清中IL-6、CRP和CD11b表達水平，并做比較分析。再比較2010年9月—2011年9月293例新生兒采用白細胞計數(shù)、血清細菌檢查和IL-6、CRP和CD11b聯(lián)合診斷方法的陽性檢出率。結果敗血癥組嬰兒血清中IL-6平均表達量為（72.9±12.3）μg/L，顯著高于未感染組（P＜0.05）；CRP的平均表達量為（24.3±4.7）mg/L，顯著高于未感染組（P＜0.05）；CD11b平均熒光強度為340±127，顯著低于未感染組（P＜0.05）。白細胞計數(shù)和血清細菌聯(lián)合檢查陽性率亦為11.60%，而IL-6、CRP和CD11b聯(lián)合檢查陽性率亦為11.60%。結論IL-6、CRP和CD11b聯(lián)合檢測具有快速（48h內(nèi)）診斷敗血癥的潛在臨床價值。

出血性敗血癥；白細胞；新生兒

敗血癥是一種多發(fā)于新生兒的常見疾病，新生兒因免疫力低下而易感染細菌，細菌感染后會在新生兒血液中繁殖并分泌出造成新生兒全身性感染的毒素［1］。新生兒一旦患病后，會引發(fā)呼吸窘迫、心率增快、低血壓、低血糖、體溫波動大、腹瀉、睡眠不穩(wěn)、黃疸等癥狀，同時能明顯看到新生兒臍帶炎和新生兒肺炎癥狀［2-4］。目前新生兒敗血癥的診斷方法有周圍白血細胞計數(shù)、體外培養(yǎng)、酶聯(lián)免疫和涂片篩查細菌等［4-6］。外周血細胞計數(shù)特異性差，體外培養(yǎng)假陽性率高且檢測周期長，涂片篩查細菌存在操作誤差。我們以多年的新生兒敗血癥診斷經(jīng)驗，總結了白細胞介素-6（inter1eukin-6，IL-6）、C反應蛋白（C-reactive protein，CRP）和中性粒細胞黏附分子（CD11b）聯(lián)合診斷方法，并且將這種方法與傳統(tǒng)的白細胞計數(shù)和涂片篩查細菌的檢出率做比較，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選擇2010年1—8月在我院出生的新生兒196例，其中診斷為新生兒敗血癥（敗血證組）36例，新生兒敗血癥發(fā)生率為18.37%，正常新生兒（未感染組）160例。敗血癥組36例，男性19例，女性17例，均在48h內(nèi)診斷結果敗血癥。未感染組160例，男性84例，女性76例。同時抽取2010 年9月—2011年9月接受檢查的293例新生兒，分別使用白細胞計數(shù)、細菌檢查和IL-6、CRP和CD11b聯(lián)合檢查。

1.2 納入標準和排除標準：納入標準如下。①新生兒敗血癥診斷符合敗血癥臨床診斷標準，即血清分離后在培養(yǎng)基上可長出致病菌，使用此條件培養(yǎng)其他血清，若能培養(yǎng)出致病菌，則可診斷為新生兒敗血癥；②診斷時采集的血清應為出生后48h內(nèi)采集的血清。排除標準如下。①母體內(nèi)母嬰感染造成的嬰兒感染；②非感染性的呼吸窘迫、心率增快、低血壓、低血糖、體溫波動大、腹瀉、睡眠不穩(wěn)、黃疸等；③正常新生兒無任何細菌感染等。

1.3 酶聯(lián)免疫檢測

1.3.1 血清采集：在新生兒出生后48h內(nèi)靜脈采集2mL靜脈血，操作過程嚴格無菌操作，采集血清先37℃水浴鍋水浴，然后2 500r/min離心10min，分離后的血清中的一部分用于進行敗血癥篩查的無菌培養(yǎng)。

1.3.2 實驗步驟：采用雙抗體夾心方法進行檢測，其中IL-6酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒購于北京冬歌生物科技有限公司），CRP酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒購于上海研生實業(yè)有限公司。按照操作手冊，每孔加入標準品20μL（復孔），另外設置樣品孔，分別進行一定比例稀釋。設置空白孔和對照孔。按照操作手冊設置的孵育方法進行一定時間孵育。使用ELx50TM系列自動洗板機對每個板進行清洗，使用試劑盒自帶的清洗液進行清洗或使用PBST（含0.05%Tween 20）進行清洗，共清洗4遍。再加入HRP標記的二抗（3種試劑盒二抗均為抗IL-6、CRP和CD11b），所有的二抗孵育條件均為37°，孵育1h。孵育結束后，使用ELx50TM系列自動洗板機清洗酶標版5次。然后加入DAB顯色液，使用2mo1/L H2SO4終止反應。

1.3.3 讀數(shù)和數(shù)據(jù)處理：在450nm處讀取數(shù)據(jù)，并且繪制標準曲線。其中IL-6標準曲線為線性回歸曲線，CRP標準曲線為二項回歸曲線。再根據(jù)標準曲線方程和樣品孔度數(shù)計算樣品孔中IL-6、CRP的表達量，再根據(jù)稀釋倍數(shù)計算原血清中IL-6、 CRP的表達量。

1.4 流式細胞儀（美國BD公司）檢測中性粒細胞膜CD11b表達：分離新生兒血清中的外周血單核細胞，使用鼠抗人CD11b和PE標記的豚鼠抗IgG1 Fc段的單抗。在避光條件下使用1∶500稀釋鼠抗人CD11b抗體孵育外周單核細胞20min，然后用PBST（含0.05%Tween20）清洗2次后再使用PE標記的二抗繼續(xù)孵育1h，再用PBST清洗3次，最終細胞用2%多聚甲醛固定，且用PBS調(diào)節(jié)細胞濃度為1 000個/μL。檢測上樣量為10μL，上機檢測參數(shù)設定為固定值，壓力為600mV，電子補償（FL1，0.5%；FL2，31.6%）。使用自帶軟件分析樣品測量樣品的平均熒光強度。

1.5 白細胞計數(shù)檢查：所有新生兒均在清晨空腹后抽取靜脈血，做白細胞計數(shù)檢查。采用全自動Ce11 Dyn 3700SL血細胞分析儀分析外周血中白細胞計數(shù)和中性粒細胞比值。其中白細胞計數(shù)（4.0～10.0）×109/L為正常值，中性粒細胞比值（30～70）%為正常。白細胞計數(shù)或中性粒細胞比值超過這個范圍，說明機體有病原體嚴重感染。

1.6 血清細菌檢查：按照參考文獻［7］進行分離細菌，并從菌落特點和生化觀察篩選到的細菌是否為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄菌、克雷伯桿菌及B組鏈球菌感染所致。

1.7 統(tǒng)計學方法：應用SPSS12.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 敗血癥組和未感染組IL-6、CRP和CD11b表達量：敗血癥組嬰兒血清中IL-6平均表達量為（72.9±12.3）μg/L，顯著高于未感染組（P＜0.05）；CRP平均表達量為（24.3±4.7）mg/L，顯著高于未感染組（P＜0.05）；CD11b平均熒光強度為340±127，顯著低于未感染組（P＜0.05）。說明IL-6、CRP和CD11b具有作為敗血癥診斷標志物的可能。見表1。

表1 敗血癥組和未感染組IL-6、CRP和CD11b表達量比較（±s）

表1 敗血癥組和未感染組IL-6、CRP和CD11b表達量比較（±s）

組別例數(shù)IL-6 （ρ/μg·L-1）CRP （ρ/mg·L-1）CD11b平均熒光強度敗血癥組3672.9±12.324.3±4.7340±127未感染組16034.2±9.46.1±1.41 035±276 t 2.708.4616.34 P 0.0210.0120.014

2.2 2010年9月—2011年9月新生兒白細胞計數(shù)檢測結果：白細胞計數(shù)檢測是敗血癥傳統(tǒng)診斷方法之一。為探討IL-6、CRP和CD11b用于敗血癥臨床診斷的標志物作用，我們選取了白細胞計數(shù)檢測作為陽性對照。結果顯示，白細胞計數(shù)超標（＞10× 109/L）34例（占受檢例數(shù)的11.60%），中性粒細胞比值異常32例（占受檢例數(shù)的10.92%）。

2.3 2010年9月—2011年9月血清細菌檢查結果：血清細菌檢查為敗血癥另一傳統(tǒng)診斷方法。所有敗血癥患兒均感染了大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄菌、克雷伯桿菌或B族鏈球菌感染，且均為單一均感染，無重復菌感染。敗血癥細菌感染者34例，占受檢例數(shù)的11.60%。見表2。

表2 2010年9月—2011年9月新生兒血清細菌檢查結果（n=293，例數(shù)，%）

2.4 IL-6、CRP和CD11b聯(lián)合檢查與白細胞計數(shù)和血清細菌聯(lián)合檢查比較結果：白細胞計數(shù)和血清細菌聯(lián)合檢查陽性率為11.60%，而IL-6、CRP和CD11b聯(lián)合檢查陽性率亦為11.60%，兩者差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。說明IL-6、CRP和CD11b聯(lián)合檢查對于診斷敗血癥具有一定指導意義，且具有臨床診斷敗血癥的潛在診斷意義。見表3。

表3 IL-6、CRP和CD11b聯(lián)合檢查與白細胞計數(shù)和血清細菌聯(lián)合檢查結果比較

3 討 論

敗血癥診斷是預防新生兒敗血癥的最有效方法，可以及時發(fā)現(xiàn)敗血癥并采取及時的治療措施。但傳統(tǒng)的白細胞計數(shù)一般是在感染后期才能有明顯的數(shù)值異常結果，不適合早期診斷。血清細菌培養(yǎng)方法培養(yǎng)時間較長，出診斷結果較慢。因此，亟需開發(fā)一種更快速的診斷方法，關于免疫應答的細胞因子、受體或者相關標志物的研究是目前疾病診斷的熱點研究課題。目前IL-6、CRP和CD11b在新生兒敗血癥診斷方面的臨床報道有很多。IL-6是Treg免疫細胞分泌表達的，在細菌免疫早期即可表達。CRP是一種單核細胞和巨噬細胞在感染后分泌的炎癥因子。CD11b的減少說明抗原遞呈細胞被激活，這個過程是細菌早期免疫應答中快速響應的環(huán)節(jié)。3個因子涵蓋了免疫應答識別、效應和調(diào)節(jié)3個方面，聯(lián)合三者診斷結果的診斷方法將具有潛在的臨床意義。歐少陽等［8］探討了IL-6和CRP聯(lián)合檢測在新生兒敗血癥早期診斷中的意義，結果顯示IL-6和CRP的敏感性分別為87%、60.8%，特異性分別為82.9%、88.6%。而陳小琴等［9］IL-6、CRP、PCT水平聯(lián)合檢測結果敏感性更高，較IL-6 和CRP聯(lián)合效果更好。崔英波等［10］深入探討了CD11b的作用，結果中性粒細胞的成熟和CD11b分子的減少是敗血癥患兒的特征現(xiàn)象，同時CD11表達下降還能體現(xiàn)感染嚴重程度。這些都為我們提供了研究思路。

本研究結果顯示IL-6、CRP和CD11b 3個因子在敗血癥和非感染患兒體內(nèi)的表達差異有統(tǒng)計學意義；傳統(tǒng)白細胞計數(shù)和血清細菌培養(yǎng)聯(lián)合檢查，與IL-6、CRP和CD11b聯(lián)合檢測比較，其陽性率差異無統(tǒng)計學意義。因此，我們可以初步判斷IL-6、CRP和CD11b聯(lián)合檢測具有快速（48h內(nèi)）診斷敗血癥的潛在臨床價值。

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［10］ 崔英波，杜立中，陳意振，等.中性粒細胞黏附分子CD11b表達對新生兒敗血癥早期診斷價值的研究［J］.中華兒科雜志，2003，41（5）：348-351.

（本文編輯：劉斯靜）

R631.3

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1007-3205（2012）10-1193-03

2012-02-21；

2012-03-26

黃正國（1973-），男，浙江富陽人，浙江省富陽市人民醫(yī)院副主任醫(yī)師，醫(yī)學學士，從事新生兒疾病診治研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.10.032