段 昕，賈春芳

（河北省張北縣中醫(yī)院內(nèi)科，河北張北 076450）

·論 著·

瑞香狼毒總黃酮提取物對肺癌細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響

段 昕，賈春芳

（河北省張北縣中醫(yī)院內(nèi)科，河北張北 076450）

目的研究瑞香狼毒總黃酮提取物對肺癌A549細(xì)胞的增殖抑制、細(xì)胞周期的影響。方法采用超聲波技術(shù)提取瑞香狼毒根中的總黃酮。四甲基偶氮唑鹽法檢測總黃酮提取物對A549細(xì)胞的增殖抑制作用，流式細(xì)胞儀檢測總黃酮提取物對A549細(xì)胞周期和凋亡的影響。結(jié)果瑞香狼毒總黃酮提取物呈明顯的時間-劑量依賴性抑制A549細(xì)胞的增殖，即隨著時間的延長、總黃酮提取物濃度的增加，抑制作用增強(qiáng)；總黃酮提取物可誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡，并將A549細(xì)胞阻滯在G1期。結(jié)論瑞香狼毒總黃酮提取物具有抗肺癌的活性。

狼毒大戟；黃酮；肺腫瘤

肺癌是嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤之一。在我國，肺癌的發(fā)病率和病死率均居各種惡性腫瘤的首位［1］。傳統(tǒng)手術(shù)、藥物等治療方法仍是目前治療肺癌的重要手段，但是由于其較強(qiáng)的不良反應(yīng)，使得部分患者因為不能耐受而不得不中斷治療。近年來，中草藥在治療惡性腫瘤中表現(xiàn)出增效減毒作用而備受關(guān)注，為尋求防治肺癌及其他腫瘤性疾病開辟了一條新路。但中草藥治療疾病目前大多數(shù)仍停留在經(jīng)驗階段，缺乏具體的藥物成分、藥效機(jī)制、安全性及不良反應(yīng)等相關(guān)研究的驗證［2］。本研究觀察了不同濃度瑞香狼毒總黃酮提取物對肺癌A549細(xì)胞的影響，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞及藥材：肺癌細(xì)胞株A549購自中科院細(xì)胞庫；瑞香狼毒根購自東莞中草藥公司。

1.1.2 試劑及藥品：RPMI1640培養(yǎng)基購于北京欣興唐生物科技有限公司；胰蛋白酶、核糖核酸酶-A、四甲基偶氮唑鹽（3-2，5-diphenyl-tetrazolium bromide，MTT）溶液和二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購自Sigma公司；胎牛血清購自Gibico公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：A549細(xì)胞培養(yǎng)于含6m L 10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2。每2～3d傳代1次。

1.2.2 瑞香狼毒總黃酮提取：將瑞香狼毒根碾磨成粉，稱取500g。采用無水乙醇浸泡過夜，超聲波提取3次，每次30min，溫度為55℃。取無水乙醇提取物加入石油醚30mL萃取，重復(fù)3次。再將提取液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀內(nèi)減壓濃縮。濃縮產(chǎn)物加蒸餾水50mL 60℃水浴2h后過濾，揮發(fā)。最后所得到的產(chǎn)物即為總黃酮提取液。-4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 MTT法檢測細(xì)胞生長抑制：將對數(shù)生長的細(xì)胞以每孔200μL的濃度加入96孔培養(yǎng)板中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，離心去除上清液，實驗孔分別加入終濃度為10、20、40、60、80mg/L的總黃酮提取物，每種濃度設(shè)5個復(fù)孔。另設(shè)空白組和對照組（不加總黃酮提取物，0mg/L）。24、48、72h后每孔加入MTT 20μL（5g/L），37℃孵育4h，棄上清，每孔加入DMSO 150μL，振搖30 min。用空白組調(diào)零，于酶標(biāo)儀檢測波長490 nm處每孔吸光度（absorbance，A）值求其平均值，計算細(xì)胞生長抑制率。以藥物濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)繪制生長曲線圖。重復(fù)3次。細(xì)胞生長抑制率=（對照組A值-試驗組A值）/對照組A值×100%。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡和周期：取對數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞的初濃度至2×105個/mL加入7個培養(yǎng)瓶當(dāng)中，加入不同濃度的總黃酮提取液，分別為終濃度為10、20、40、60、80mg/L，并另設(shè)空白組和對照組，共7組。48h后用胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，1 200r/min離心5min收集細(xì)胞。24h后加預(yù)冷的0.5mL PBS液吹打混勻。將細(xì)胞吸起5mL至70%乙醇中24h后1 200r/min離心5min。收集細(xì)胞加入0.4m L PBS和6μL RNase-A，37℃水浴40min。加入碘化丙啶（propidium iodide，PI）約50μL 4℃避光染色15min。用300目尼龍網(wǎng)過濾后流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期。以上實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法：應(yīng)用SPSS15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞生長抑制實驗結(jié)果：不同濃度的瑞香狼毒總黃酮提取物處理人肺癌細(xì)胞A549 24、48、72h后，用MTT法檢測細(xì)胞的活性。結(jié)果顯示，瑞香狼毒總黃酮提取物呈明顯的時間-劑量依賴性抑制A549細(xì)胞的增殖。藥物在低濃度時對A549細(xì)胞抑制作用不是很明顯，但是隨著提取物濃度的增加，抑制效果顯著增強(qiáng)；在相同濃度藥物的情況下，隨著作用時間的延長，抑制率增大。采用80mg/L提取物作用A549細(xì)胞72h后，抑制率高達(dá)79.3%。見表1。

表1 不同濃度瑞香狼毒總黃酮提取物作用24、48及72h后對A549細(xì)胞的抑制率

2.2 細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果：采用不同濃度總黃酮提取物處理肺癌細(xì)胞A549 48h后，用流式細(xì)胞儀檢測凋亡情況?？傸S酮提取物10、20、40、60、80mg/L處理后的細(xì)胞凋亡率分別為（9.03±0.32）%、（10.48±0.41）%、（12.71±0.23）%、（16.09± 0.61）%、（30.99±1.56）%、（51.6±2.87）%，與對照組（6.98±0.32）%相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且各干預(yù)組兩兩比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 細(xì)胞周期檢測結(jié)果：分析結(jié)果顯示，A549細(xì)胞經(jīng)不同濃度總黃酮提取物處理48h后，細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞增多，S和G2/M期細(xì)胞減少。隨著藥物的濃度增加，G0/G1期細(xì)胞從（45.6±5.6）%（0mg/L）升高到（83.9±7.9）%（80mg/L）；S期細(xì)胞從（27.3 ±3.2）%（0mg/L）降低到（16.1±3.8）%（80mg/ L）；G2/M期細(xì)胞從（15.0±2.6）%（0mg/L）降低到（5.9±1.0）%（80mg/L）（圖1）。這表明總黃酮提取物可使細(xì)胞阻滯于G1期。

3 討 論

瑞香狼毒是瑞香科狼毒屬多年生草本有毒植物，為傳統(tǒng)中藥，性味苦平，具有殺菌、殺蟲、散結(jié)等功效。國內(nèi)研究顯示瑞香狼毒具有一定的抗肺癌作用效果［3］。楊寶?。?］采用瑞香狼毒治療惡性腫瘤54例，其中包括肺癌6例，治療1個月以上有效率為63%，1年生存率達(dá)16%，顯著高于對照組的4.6%（P＜0.05），提示瑞香狼毒具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的功效。陳偉等［5］同樣發(fā)現(xiàn)用狼毒與雞血藤、苡米、半枝蓮等制成復(fù)方狼毒注射液可用于治療晚期肺癌。但瑞香狼毒抗腫瘤的有效成分及其作用機(jī)制仍不清楚。

狼毒的主要成分包括香豆素類、黃酮類、二萜類、三萜類、木質(zhì)素類等［6］。瑞香狼毒的有效成分對肺癌細(xì)胞或其他腫瘤細(xì)胞具有一定的抑制、促凋亡作用。樊俊杰等［7］分別觀察了瑞香狼毒水和醇提取物對小鼠lewis肺癌細(xì)胞生長影響。瑞香狼毒水提物5～20g/kg對小鼠lewis肺癌生長抑制率為10.9%～40.6%；醇提物2.5～10g/kg對lewis肺癌生長抑制率為20.1～40.8%，且呈劑量反應(yīng)關(guān)系。其他研究［8-9］同樣發(fā)現(xiàn)瑞香狼毒水和醇提取物對肺癌細(xì)胞增殖、凋亡具有一定的效果。雖然采取了水或醇的提取，但提取物中的成分仍然十分的復(fù)雜。目前，越來越多的研究致力于探索瑞香狼毒的具體成分。如采用色譜法分離出的活性成分gnidimacrin具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，具有一定的臨床應(yīng)用價值。

目前，國內(nèi)外尚未見采用超聲波方法提取瑞香狼毒中總黃酮作用于肺癌細(xì)胞的研究報道。王敏等［10］觀察了瑞香狼毒總黃酮提取物的抗人胃癌細(xì)胞SGC-7901、人肝癌細(xì)胞BEL-7402和人白血病細(xì)胞HL-60的效果。MTF法檢測結(jié)果表明，瑞香狼毒總黃酮提取物與長春新堿對體外培養(yǎng)的人胃癌細(xì)胞SGC-7901和人肝癌細(xì)胞BEL-7402增殖都表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，呈現(xiàn)較好的劑量依賴性抑制作用，且瑞香狼毒總黃酮提取物的急性毒性小。本研究首次觀察超聲波法提取瑞香狼毒總黃酮成分作用肺癌細(xì)胞A549。結(jié)果顯示瑞香狼毒總黃酮提取物呈明顯的時間-劑量依賴性抑制A549細(xì)胞的增殖，即隨著時間的延長、總黃酮提取物濃度的增加，抑制作用增強(qiáng)，采用80mg/L提取物作用A549細(xì)胞72h后，抑制率高達(dá)79.3%。總黃酮提取物可誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡，并將A549細(xì)胞阻滯在G1期。本研究初步結(jié)果顯示瑞香狼毒總黃酮提取物具有抗肺癌細(xì)胞的活性，但瑞香狼毒總黃酮通過何種途徑抑制肺癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡等具體的作用機(jī)制，除了A549肺癌細(xì)胞株，對其他類型的肺癌細(xì)胞是否有同樣的效果還有待于進(jìn)一步的研究。

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（本文編輯：趙麗潔）

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1007-3205（2012）03-0308-03

2011-12-16；

2012-01-30

段昕（1974-），男，河北張北人，河北省張北縣中醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)學(xué)士，從事內(nèi)科疾病診治研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.03.023