侯麗華，于雁飛，王 川，王春玲

(食品營(yíng)養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457)

魯氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)又稱 S酵母，主要應(yīng)用于醬油的高鹽稀態(tài)發(fā)酵過程中，用以改善醬油的風(fēng)味[1-2]．S酵母是與模式生物釀酒酵母相近的半子囊菌酵母．魯氏酵母可在高鹽的環(huán)境中生長(zhǎng)，比如，在醬油高鹽稀態(tài)發(fā)酵工藝的后期鹽水發(fā)酵中含鹽量高達(dá)17%，魯氏酵母依然能夠生長(zhǎng)及發(fā)酵[3].但是在此環(huán)境中包括釀酒酵母在內(nèi)的大多數(shù)酵母都不能生長(zhǎng)．

目前，一些關(guān)于魯氏酵母的耐鹽、耐滲的基因，如 ZrPMA1、ZrSOD2、ZrSOD22、ZrGPD1、ZrHOG1和 ZrHOG2等已經(jīng)被克隆和測(cè)序[4-6]．其中，GPD1即 3–磷酸甘油脫氫酶(glycerol-3-phosphate dehydrogenase)的編碼基因，其編碼的酶可使磷酸二羥丙酮生成 3–磷酸甘油，從而增加甘油含量，在酵母耐鹽的滲透調(diào)節(jié)中發(fā)揮舉足輕重的作用[7]．因此，本文對(duì)魯氏酵母的耐鹽基因 GPD1進(jìn)行研究，使其在模式酵母即釀酒酵母實(shí)驗(yàn)室菌株W303中過量表達(dá)，研究其對(duì)釀酒酵母耐鹽性、甘油產(chǎn)量等的影響，為構(gòu)建耐鹽菌株奠定理論基礎(chǔ)，為闡述酵母菌株的耐鹽機(jī)制提供更多的理論依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)基

魯氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)、釀酒酵母W303(Saccharomyces cerevisiae W303，MATa，leu2-3/112，ura3-1，trp1-1，his3-11/15，ade2-1，can1-100，GAL，SUC2，mal 0)、多拷貝酵母(S. cerevisiae)與大腸桿菌(E. coli)的穿梭質(zhì)粒 YEplac195(Ampr，URA3)，為本實(shí)驗(yàn)室保存．

YPD 培養(yǎng)基(g/L)：酵母浸粉 10，葡萄糖 20，蛋白胨 20，121,℃滅菌 20,min．其中，40%葡萄糖溶液115,℃滅菌20,min后，加入培養(yǎng)基中使含量達(dá)到2%．

CM-ura培養(yǎng)基(g/L)：無氨基酸的酵母氮源(YNB)6.7，腺嘌呤0.05，組氨酸0.1，色氨酸0.1，亮氨酸0.1，精氨酸0.02，天冬氨酸0.1，谷氨酸0.1，異亮氨酸0.03，賴氨酸0.03，甲硫氨酸0.02，苯丙氨酸0.05，絲氨酸0.15，蘇氨酸0.15，酪氨酸0.03，纈氨酸0.15，調(diào)節(jié)pH為6.5，加入1.5%的瓊脂，121,℃滅菌 15,min．

1.1.2 試劑與儀器

十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖，Gene Tech(上海)有限公司；Easy Pfu DNA Polymerase、Easy Pfu 10×buffer、Ligase 10×Buffer、T4,DNA Ligase，加拿大 Fermentas生物技術(shù)公司；2.5,mmol/L dNTPs，北京全式金生物技術(shù)公司；HindⅢ內(nèi)切酶、10×M Buffer、SphI 內(nèi)切酶、10×H Buffer，日本東洋坊公司；腺嘌呤、組氨酸、色氨酸、亮氨酸等 15種氨基酸、無氨基酸的酵母氮源(YNB)，BBI公司．

電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器廠；飛鴿牌微量離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；My CyclerTM PCR 儀、DYY–6C 型水平電泳儀、凝膠成像儀，美國(guó) Bio-Rad公司；紫外分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司．

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)魯氏酵母基因數(shù)據(jù)(http：//www.genolevures.org/zyro.html，序號(hào)為 ZYRO0A055390g)設(shè)計(jì)引物，GDP1-up：5′-GCGCATGCGTTGTTGTTGTC ATCACTC-3'(SphI) ；GDP1-dn ：5′-GCAAGCTTTT GTCTTTCTAATACAC-3′(HindⅢ)．GPD1 目的片段上游引物 5′端引入 SphI酶切位點(diǎn)(GCATGC)，下游引物 5′端引入 HindⅢ酶切位點(diǎn)(AAGCTT)．引物由上海生工公司合成．

1.2.2 構(gòu)建質(zhì)粒

提取魯氏酵母基因組，并以其為模板，以 GDP1-up和 GDP1-dn為引物作 PCR擴(kuò)增(95,℃模板預(yù)變性 3,min；95,℃模板變性，55、58、60,℃引物退火1.5,min，72,℃引物延伸 2,min，共 30個(gè)循環(huán)；最后72,℃再延伸 10,min)．純化 PCR產(chǎn)物，并用 SphI和HindⅢ雙酶切，將酶切產(chǎn)物連入到同樣雙酶切的YEplac195中，得到重組質(zhì)粒YEplac195-GPD1．

1.2.3 耐鹽性變化實(shí)驗(yàn)

分別取 200,mL滅菌后含鹽量為 0、9%、18%的YPD 培養(yǎng)基各 3瓶，其中分別接種 106,mL–1的菌種2,mL．將上述樣品置于搖床中 180,r/min、30,℃培養(yǎng)，每隔4,h取樣測(cè)A600的值．

1.2.4 抗性實(shí)驗(yàn)

將待測(cè)菌株接種到 YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)(30,℃，12,h，轉(zhuǎn)速＜200,r/min)；測(cè) A600值，計(jì)算細(xì)胞濃度，取出約含5×106個(gè)細(xì)胞的菌液加入到1,mL新鮮培養(yǎng)液中活化 2,h；測(cè) A600值，計(jì)算細(xì)胞濃度，取出約含2×106個(gè)細(xì)胞的菌液，10,000,r/min離心1,min，棄上清液；加入20,μL無菌水混勻，終濃度為1×106,μL-1．取 2,μL 加入到 18,μL 無菌水中稀釋 10倍．同樣方法按濃度遞增順序分別得到1×106、1×105、1×104、1×103、1×102,μL-1的菌液．每個(gè)稀釋度取 3,μL菌液滴在所需平板上，超凈臺(tái)晾干后，30,℃倒置培養(yǎng)．

1.2.5 甘油產(chǎn)量的測(cè)定

Cu(OH)2懸濁液的配制：取 5支試管．各注入1,mL 0.05,g/mL 的 CuSO4溶液和 3.5,mL 0.05,g/mL的NaOH溶液，振蕩，生成Cu(OH)2懸濁液．

甘油銅溶液的配制：向上述 Cu(OH)2懸濁液的試管中分別注入 6‰、7‰、8‰、9‰、10‰的甘油標(biāo)準(zhǔn)品溶液 0.5,mL，充分振蕩，即生成甘油銅溶液，離心分離，取上清液備用；以超純水為空白，630,nm 為測(cè)定波長(zhǎng)．以 Cu(OH)2為橫坐標(biāo)，630,nm 下的吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線．樣品如上操作，將測(cè)得的值代入公式計(jì)算即可得出甘油產(chǎn)量[8]．

2 結(jié)果與討論

2.1 工程菌株的構(gòu)建

將構(gòu)建的質(zhì)粒 YEplac195-GPD1(見圖 1)轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(TOP10)中，提取質(zhì)粒后，用 SphI與 HindⅢ雙酶切驗(yàn)證，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(見圖2)．然后將質(zhì)粒 YEplac195-GPD1和空質(zhì)粒 YEplac 195分別轉(zhuǎn)入釀酒酵母實(shí)驗(yàn)室菌株W303中[9]，得到工程菌株WYS和對(duì)照菌株WY．

圖1 質(zhì)粒YEplac195-GPD1結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic view of the plasmid YEplac195-GPD1

圖2 重組表達(dá)質(zhì)粒的SphI 和HindⅢ雙酶切鑒定Fig.2 Analysis of recombined plasmid digested by SphI and HindⅢ

2.2 耐鹽性變化

對(duì)工程菌株 WYS和對(duì)照菌株 WY在含鹽量為0、9%、18%的 YPD 培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況進(jìn)行研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示．

因?yàn)樵谝欢舛认拢湍讣?xì)胞在 600,nm下的吸光度與細(xì)胞個(gè)數(shù)有對(duì)應(yīng)關(guān)系，所以本文中通過測(cè)定不同菌株在600,nm波長(zhǎng)下的吸光度來反映菌株的生長(zhǎng)狀況．由圖 3可知，隨著鹽的加入，菌株 WYS和對(duì)照菌株 WY到達(dá)對(duì)數(shù)期的時(shí)間變長(zhǎng)．這說明鹽的加入，使得細(xì)胞內(nèi)外滲透壓發(fā)生變化，從而影響細(xì)胞增殖，導(dǎo)致到達(dá)對(duì)數(shù)期的時(shí)間延長(zhǎng)且延緩對(duì)數(shù)期細(xì)胞的增殖．但是，在每個(gè)含鹽量下，WYS與對(duì)照菌株 WY相比，對(duì)細(xì)胞的抗?jié)B透壓耐鹽作用仍舊可以明顯表現(xiàn)出來．

由上述分析可知，重組后的質(zhì)粒 YEplac195-GPD1明顯比空質(zhì)粒 YEplac195促進(jìn)了酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)，不僅表現(xiàn)在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的提前，而且平穩(wěn)期的細(xì)胞數(shù)量也有所增加，這說明基因 GPD1對(duì)于酵母細(xì)胞耐鹽性的重要作用．

圖3 菌株在不同含鹽量YPD培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況Fig.3 Growth of engineered strains in YPD culture media with different salt concentration

2.3 抗性變化

分別研究菌株 WYS和 WY 對(duì) LiCl、鹽、山梨醇、乙醇和高溫的抗性，結(jié)果如圖 4所示，從左到右菌體的濃度依此為 1×106、1×105、1×104、1×103、1×102,μL-1．

由圖 4可見，在 LiCl、NaCl、乙醇不同程度刺激而產(chǎn)生的滲透壓力下[2]，WYS生長(zhǎng)趨勢(shì)明顯優(yōu)于WY，表現(xiàn)出了較好的耐性；對(duì)比圖 4(a)和圖 4(e)發(fā)現(xiàn)，(a)組菌落比(e)組菌落大而圓，這說明隨著鹽的加入，導(dǎo)致了細(xì)胞內(nèi)水分的外流，細(xì)胞發(fā)生了質(zhì)壁分離現(xiàn)象．而1,mol/L的山梨醇濃度對(duì)于該系列菌株來說并無太大影響．42,℃培養(yǎng)對(duì)兩株菌株的影響基本相同，只有最高濃度才能生長(zhǎng)，但是 WYS的生長(zhǎng)優(yōu)于WY，表明過量表達(dá)GPD1對(duì)細(xì)胞耐受熱具有明顯的作用．

圖4 工程菌株的抗性比較Fig.4 Tolerance comparison of engineered strains

2.4 甘油產(chǎn)量變化

按照 1.2.5方法得到標(biāo)準(zhǔn)曲線 y＝0.044,3x＋0.001,3，R2＝0.999,6．將工程菌株WYS和WY 分別培養(yǎng)在含鹽量為0、9%、18%的YPD培養(yǎng)基中，30,℃培養(yǎng)．當(dāng)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)后期，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)外甘油產(chǎn)量，如圖5所示．

圖5 甘油產(chǎn)量變化Fig.5 Changes of glycerol content

由圖 5可知，隨著含鹽量的增加，WYS和 WY菌株的甘油產(chǎn)量都依次增加，但增加的程度并不一致，這表明它們對(duì)環(huán)境的應(yīng)答并不完全一樣．對(duì)于同一菌株，隨著含鹽量的增加，其甘油產(chǎn)量也隨之增加；對(duì)于同一個(gè)含鹽量，WYS菌株的甘油產(chǎn)量高于WY，結(jié)合圖 4(e)結(jié)果，這說明 WYS中過量表達(dá)GPD1使其更能適應(yīng)外界滲透壓的變化．

3 結(jié) 語(yǔ)

基因 GPD1只是耐鹽通路中的一個(gè)小分支，要進(jìn)一步闡明酵母菌株的耐鹽機(jī)制，將需要研究此通路中的其他關(guān)鍵基因，如FPS1(編碼甘油由胞內(nèi)向胞外滲透的通道蛋白)、PMA1(編碼質(zhì)膜 H+-ATPase)、PDC1(編碼丙酮酸脫羧酶)、ALD6(編碼胞質(zhì)乙醛脫氫酶)等．還需建立起一個(gè)立足點(diǎn)較多的基因功能網(wǎng)絡(luò)，結(jié)合酵母的代謝網(wǎng)絡(luò)，對(duì)醬油添加酵母的耐鹽機(jī)制進(jìn)行研究．此外，在本研究中只是對(duì)過量表達(dá)魯氏酵母耐鹽基因 GPD1對(duì)釀酒酵母 W303的影響進(jìn)行了分析，并沒有研究自身過表達(dá) GPD1對(duì)耐鹽家族成員魯氏酵母的影響．因此在后續(xù)的研究中可以利用質(zhì)粒 pZEU[10]在魯氏酵母△ura3缺陷型菌株中過量表達(dá)耐鹽基因GPD1．

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