徐海琦 林輝榮 吳春麗 徐營（嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 嘉興 314001）

卵母細(xì)胞是哺乳動(dòng)物體內(nèi)最大的一種細(xì)胞，承載著繁衍后代的使命，而卵子的發(fā)育成熟是其完成生殖過程的先決條件。對(duì)卵泡的生長、發(fā)育和卵子成熟調(diào)控機(jī)制的研究一直是發(fā)育生物學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。

卵母細(xì)胞來源于原始生殖細(xì)胞（Primordial germcells，PGC），胚胎發(fā)育期間，PGC進(jìn)入生殖嵴不斷生長發(fā)育，在出生前后停滯在第一次減數(shù)分裂前期（即初級(jí)卵母細(xì)胞），直到性成熟才恢復(fù)減數(shù)分裂。初級(jí)卵母細(xì)胞被一層卵泡顆粒細(xì)胞包圍，構(gòu)成原始卵泡。性成熟期，原始卵泡啟動(dòng)發(fā)育，形成初級(jí)卵泡，進(jìn)一步發(fā)育成次級(jí)卵泡及最后的成熟卵泡。成熟卵泡隨之破裂，發(fā)生排卵，此時(shí)的卵細(xì)胞為具有受精能力的成熟卵母細(xì)胞。卵泡發(fā)育期間，卵母細(xì)胞周圍的顆粒細(xì)胞也不斷增殖和分化［1］（如圖）。

圖1 卵母細(xì)胞與周圍體細(xì)胞的相互作用

1 卵母細(xì)胞的發(fā)育、成熟階段

這是一個(gè)非常復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過程，它主要由2方面的因素調(diào)控。一方面通過卵巢內(nèi)微環(huán)境中的細(xì)胞因子調(diào)控，另一方面是通過下丘腦—垂體—卵巢所釋放的激素調(diào)控，即中樞神經(jīng)內(nèi)分泌進(jìn)行調(diào)節(jié)。生長因子對(duì)卵母細(xì)胞成熟的作用是正向的。發(fā)育卵泡中存在多種促生長因子及其受體，它們同時(shí)影響卵膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞的增殖和分化，并參與調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞的成熟。卵巢內(nèi)微環(huán)境局部的卵泡膜細(xì)胞、顆粒細(xì)胞以及卵母細(xì)胞等產(chǎn)生的自分泌和旁分泌調(diào)節(jié)因子，直接調(diào)控卵子的發(fā)育和成熟。研究表明，卵巢組織內(nèi)合成分泌的白細(xì)胞介素（Interleukin，IL）［2］、胰島素樣生長因子－1（Insulin－like growth factor－1，IGF－1）［3］、表皮生長因子（Epidermal growth factor，EGF）［4］、轉(zhuǎn)化生長因子－β（Transforming growth factor－β，TGF－β）［5］、生長分化因子－9（Growth differentiation factor－9，GDF－9）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白－15（bone morphogenetic protein－15，BMP－15）［6］、成熟促進(jìn)因子（M－phase promoting factor，MPF）［7］等多種非激素類分子參與調(diào)節(jié)卵細(xì)胞的發(fā)育與成熟過程。近年來，隨著分子生物學(xué)的研究進(jìn)展，圍繞絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路［8］、G蛋白耦聯(lián)受體介導(dǎo)的信號(hào)通路、受體酪氨酸激酶（Receptor tyrosine kinase－Ras，RTK－Ras）信號(hào)通路、磷脂酰肌醇3－激酶（Phospho－inositide 3－kinases，PI3K）－蛋白激酶B（Protein kinase B，PKB或 Akt）信號(hào)通路、TGF－β信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路等在卵細(xì)胞發(fā)育成熟過程中的作用，也進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究。

卵母細(xì)胞成熟抑制因子（OMI）是指卵泡液中能夠抑制卵母細(xì)胞成熟的物質(zhì)。OMI是一個(gè)多肽，分子量約為1～2kDa，許多哺乳動(dòng)物卵巢的卵泡液中均存在，并且在卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)中可阻止自發(fā)減數(shù)分裂成熟。目前研究較多的成熟抑制因子有環(huán)核苷酸和嘌呤。FST主要在卵巢的顆粒細(xì)胞中合成，而顆粒細(xì)胞又是與卵母細(xì)胞直接接觸的唯一的細(xì)胞，因此，F(xiàn)ST在卵母細(xì)胞的成熟與退化過程上起著非常重要的作用。FST可以通過調(diào)節(jié)卵巢顆粒細(xì)胞的分化和成熟，并與活化相互作用，影響卵泡發(fā)育與閉鎖，繼而影響卵母細(xì)胞成熟過程［9］。

另一方面是通過下丘腦—垂體—卵巢所釋放的激素調(diào)控，即中樞神經(jīng)內(nèi)分泌進(jìn)行調(diào)節(jié)。激素是促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟的重要物質(zhì)，如促性腺激素、性激素及類固醇激素等［10－12］。激素是哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞成熟的重要物質(zhì)。目前，絕大多數(shù)研究者在卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)過程中，添加促性腺激素或類固醇激素或兩者的混合物。但是，它們?cè)诼涯讣?xì)胞體外成熟過程中的作用及作用機(jī)理尚未清楚。根據(jù)已有的研究結(jié)果推測(cè)，激素誘導(dǎo)卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂可能通過2條途徑：①誘導(dǎo)卵丘擴(kuò)散使顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞的間隙連接中斷，使卵丘細(xì)胞的信息不能傳入卵母細(xì)胞，從而解除卵丘細(xì)胞對(duì)卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂的抑制作用，重新啟動(dòng)減數(shù)分裂。②誘導(dǎo)卵丘細(xì)胞產(chǎn)生一些刺激因子，克服抑制物質(zhì)的作用而恢復(fù)減數(shù)分裂?，F(xiàn)在，體外成熟培養(yǎng)中，主要以添加LH和hCG為主。Funashi等的研究表明，在豬卵母細(xì)胞體外成熟時(shí)，培養(yǎng)的前20h加入激素，培養(yǎng)20h后去掉激素，可增加卵母細(xì)胞體外成熟率，促進(jìn)卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂和細(xì)胞質(zhì)成熟。同時(shí)指出，在豬卵母細(xì)胞體外成熟中，有兩個(gè)關(guān)鍵步驟是受激素調(diào)節(jié)的。一是核成熟，它可由培養(yǎng)的前20h加入激素所激發(fā)；二是細(xì)胞質(zhì)成熟，在培養(yǎng)的后20 h去掉一部分或全部激素可以促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)的成熟［13］。Delos－Reyes［14］等的研究也發(fā)現(xiàn)，在豬卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)的第2階段去掉激素可以提高卵母細(xì)胞的體外成熟率。

有研究報(bào)道，豬卵母細(xì)胞的體外成熟伴隨卵丘細(xì)胞的擴(kuò)散，擴(kuò)散的卵丘細(xì)胞能夠調(diào)節(jié)諸如氨基酸、核苷酸、磷脂酸、激素、蛋白質(zhì)等物質(zhì)在卵母細(xì)胞內(nèi)外的進(jìn)出，誘導(dǎo)卵母細(xì)胞排出有害因子，從而有效地抑制卵母細(xì)胞的退化［15－16］。卵母細(xì)胞在生長發(fā)育中所釋放的生長因子對(duì)卵丘細(xì)胞的生長也有一定的促進(jìn)作用，卵母細(xì)胞與卵丘細(xì)胞的這種相互作用使得兩者共同發(fā)育生長，最終促進(jìn)了卵母細(xì)胞的成熟。

2 卵母細(xì)胞退化機(jī)制

減數(shù)分裂紊亂以及細(xì)胞分裂基因的表達(dá)異常是人類以及其他高齡哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞退化的主要機(jī)制之一。卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂是由很多因子參與的精確、有序的調(diào)節(jié)過程，其中后期同源染色體／姐妹染色單體的分離對(duì)于維持基因組的完整性起重要作用，其分離缺陷會(huì)引起非整倍性，并導(dǎo)致出生缺陷。Hassold等研究認(rèn)為卵母細(xì)胞的質(zhì)量低下、數(shù)量下降，由減數(shù)分裂錯(cuò)誤引起的卵母細(xì)胞質(zhì)量下降是與衰老相關(guān)生育力下降的主要原因之一［17－19］，即發(fā)生了與年齡相關(guān)的卵母細(xì)胞退化。卵母細(xì)胞退化是衰老造成母源性生育力下降的主要因素。

Tarín的實(shí)驗(yàn)表明，老化的卵母細(xì)胞受精產(chǎn)生的后代繁殖性能和壽命均下降［20］?？梢?，老化的卵母細(xì)胞對(duì)后代產(chǎn)生了嚴(yán)重負(fù)面影響。然而是什么機(jī)制導(dǎo)致了排卵后卵母細(xì)胞的老化，卵母細(xì)胞在老化過程中究竟發(fā)生了哪些變化是目前研究的熱點(diǎn)。

老齡動(dòng)物的卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂前在卵巢內(nèi)停滯很長時(shí)間，這漫長的時(shí)間里，各種各樣內(nèi)在和外源的因素可以引起紡錘體前體的降解和染色體損傷，其中與線粒體有關(guān)的氧化應(yīng)激是一主要因素。Friedman等［21］報(bào)道隨年齡而增加，缺氧直接引起或再充氧后間接引起氧化應(yīng)激產(chǎn)生。氧化應(yīng)激損傷衰老期間的DNA和染色體及蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)可能涉及到對(duì)紡錘體組裝重要的微管和小分子。許多染色體相關(guān)或著絲粒相關(guān)的蛋白質(zhì)，如Mps1、Mad2和Xkid，已表明在染色體于紡錘體中期板上的排列發(fā)揮重要作用［22］。總之，老齡個(gè)體減數(shù)分裂異?？赡苁窃S多因素?fù)p傷了紡錘體和染色體成分和／或改變了減數(shù)分裂各時(shí)期的時(shí)序，導(dǎo)致紡錘體紊亂和染色體排列異常。卵母細(xì)胞在遺傳學(xué)及生物學(xué)方面受到年齡的影響，其中由分裂錯(cuò)誤所導(dǎo)致的非整倍性增加和染色單體早現(xiàn)被認(rèn)為與衰老相關(guān)卵母細(xì)胞質(zhì)量下降方面起有主要作用。在人，卵母細(xì)胞和胚胎非整倍性的比率隨母體年齡增長而顯著增加［23］，Eichenlaub－Ritter［24］統(tǒng)計(jì)了4000多個(gè)老齡人的 MⅡ期卵母細(xì)胞，其中8.6%為超倍性，13.5%為低倍性，因此保守的估計(jì)（非整倍性相當(dāng)于2倍超倍體的水平）有17.2%的卵母細(xì)胞染色體異常，在估計(jì)整個(gè)非整倍性水平時(shí)若也算上低倍性則有20%以上的卵母細(xì)胞染色體異常?？紤]到MⅡ期卵母細(xì)胞的非整倍性僅反映了第一次減數(shù)分裂錯(cuò)誤的程度，完成第二次減數(shù)分裂后非整倍性的比率在老齡個(gè)體會(huì)更高。Eichenlaub－Ritter等［25］報(bào)道老齡小鼠MⅡ期卵母細(xì)胞染色體數(shù)異常的比例顯著高于年輕小鼠，同時(shí)高比例（P＜0.001）的老齡小鼠卵母細(xì)胞在 MⅡ期含一條或幾條染色單體。

現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)了許多與卵母細(xì)胞退化相關(guān)的基因。這些基因包括 GDF29、Fac、AtrPAtm、Mlh1、Zfx、ER、Cyclin D2、Connexin 37、bcl－2、ob、c－mos、p27〔kip1〕、C／ERPbeta、Hook等，它們的特征表現(xiàn)為以下幾個(gè)方面：①影響卵巢發(fā)育及卵泡成熟，如p27〔Kip1〕、c－mos，敲除這些基因?qū)?dǎo)致排卵數(shù)的下降，但有關(guān)的調(diào)控機(jī)理目前尚不清楚；②調(diào)控細(xì)胞周期并影響卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂，如AtrPAtm，它們分別定位于減數(shù)分裂中聯(lián)會(huì)與非聯(lián)會(huì)的染色體上，將它們敲除會(huì)導(dǎo)致偶線期P粗線期的阻滯。而缺少c－mos的卵母細(xì)胞則會(huì)產(chǎn)生異常的紡錘體及錯(cuò)誤的染色體濃縮，最終導(dǎo)致卵母細(xì)胞MⅡ期阻滯的失敗，激活孤雌生殖；③對(duì)激素調(diào)控起作用，如ER等；④與染色體分離和微管骨架有關(guān)。Hamatani等［26］研究發(fā)現(xiàn)隨著母親年齡增大，Cggbp1等與染色體分離及微管骨架有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄下降。

通過對(duì)酵母的研究發(fā)現(xiàn)，粘著蛋白（Cohesin）可以調(diào)節(jié)染色體的正確分離，姐妹染色單體是靠粘著蛋白形成的粘著力緊密的連在一起，在S期與姐妹染色單體結(jié)合，在中期向后期過度時(shí)從染色體上解離的。2001年Dobie等人研究發(fā)現(xiàn)了wapl基因與染色體的分離有關(guān)，但具體機(jī)制并不是很清楚。突變的wapl基因在異染色質(zhì)區(qū)域阻止了姐妹染色單體的正?？拷筒⒘?，但是不影響染色體的凝集和分離。wapl基因在有絲分裂的異染色質(zhì)區(qū)域?qū)τ诰S持姐妹染色單體的粘連起著非常重要的作用，具有調(diào)節(jié)染色體遺傳的功能。在293T細(xì)胞wapl的過表達(dá)使細(xì)胞早熟姐妹染色單體分離頻率增高，引起非整倍的產(chǎn)生。wapl缺失后細(xì)胞就短暫的停滯在前中期，姐妹染色單體分離率下降，并在后期出現(xiàn)多分裂核現(xiàn)象，同時(shí)粘著蛋白表達(dá)量也增加。許多染色體相關(guān)或著絲粒相關(guān)的蛋白質(zhì)，如 Mps1、Mad2已表明在染色體于紡錘體中期板上的排列發(fā)揮重要作用。而在卵母細(xì)胞成熟發(fā)育過程中，染色體的分離依賴于紡錘體，若紡錘體出現(xiàn)異常，細(xì)胞分裂就不能正常完成，從而卵子就不能進(jìn)行正常受精、卵裂。

減數(shù)分裂異常是卵母細(xì)胞退化的一種顯著特征。低質(zhì)量的卵母細(xì)胞影響減數(shù)分裂中染色體的分離，導(dǎo)致胚胎在附植前后丟失或產(chǎn)生三倍體，進(jìn)而影響人類及其他哺乳動(dòng)物的生育。有證據(jù)表明老齡動(dòng)物卵母細(xì)胞在第二次減數(shù)分裂時(shí)也出現(xiàn)異常。Liu等發(fā)現(xiàn)MⅡ期結(jié)束時(shí)非整倍體的比率在老齡鼠中明顯升高，這表明染色體的錯(cuò)誤分離在減數(shù)分裂期也有發(fā)生，而且確實(shí)與母親年齡相關(guān)。此外，Battaglia與Volarcik等發(fā)現(xiàn)，與年輕女性的卵母細(xì)胞相比，中老年婦女的MⅡ期卵母細(xì)胞紡錘體更松散，而且染色體與紡錘體在不同的位點(diǎn)無規(guī)則地相連。

3 展望

綜合以上所述，衰老導(dǎo)致的哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞發(fā)育成熟過程及體外老化過程中所發(fā)生的變化，尤其是細(xì)胞分裂（減數(shù)分裂）相關(guān)分子表達(dá)變化的研究方面還處于起步階段，存在諸多的未知未明之處，有待于進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

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