王 鵬，詹長(zhǎng)娟，楊軍方，李大力

(南京理工大學(xué)環(huán)境與生物工程學(xué)院，江蘇 南京 210094)

γ-聚谷氨酸(γ-Polyglutamic acid，γ-PGA) 是由谷氨酸通過(guò)γ-酰胺鍵結(jié)合形成的一種多肽大分子，應(yīng)用于生物醫(yī)藥材料、化妝品、食品、分散劑、螯合劑、建筑涂料等領(lǐng)域[1～4]。目前，制備γ-PGA的方法有化學(xué)合成法、提取法、微生物發(fā)酵法，其中微生物發(fā)酵法較適合于工業(yè)化生產(chǎn)[5～7]。

S-腺苷甲硫氨酸(S-Adenosylmethionine，SAM)也稱(chēng)S-腺苷蛋氨酸，是人體內(nèi)一種重要的生理活性物質(zhì)，參與多種生化反應(yīng)，如轉(zhuǎn)甲基、轉(zhuǎn)硫、轉(zhuǎn)氨丙基等，是半胱氨酸、?；撬帷⒐入赘孰?、輔酶A等重要物質(zhì)的前體[8]，在治療肝炎、肝功能紊亂、關(guān)節(jié)炎、抑郁癥、心血管疾病以及抗衰老、防癌等方面發(fā)揮著重要作用，市場(chǎng)需求日益增大[8,9]。SAM在pH>5時(shí)易分解，與有機(jī)分子形成鹽有利于提高SAM的穩(wěn)定性[10～12]。

作者利用從納豆芽孢桿菌(Bacillusnatto) NL365發(fā)酵液中提取純化的γ-PGA，制備了γ-聚谷氨酸腺苷甲硫氨酸鹽(γ-PGA-SAM)，以利用γ-PGA的空間位阻來(lái)提高SAM的穩(wěn)定性，有利于SAM在臨床上的應(yīng)用。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌種與試劑

納豆芽孢桿菌(Bacillusnatto) NL365、釀酒酵母均為自行保存。

丁二磺酸腺苷甲硫氨酸，Abbott S.P.A.公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 培養(yǎng)基

納豆芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1)：葡萄糖30，酵母粉8，谷氨酸鈉60，NaCl 45，pH值7.0,于37 ℃、220 r·min-1搖床培養(yǎng)4 d。

釀酒酵母發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1)：蔗糖40，NH4NO35，MgSO4·7H2O 0.4，ZnSO4·7H2O 0.3，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.2，CaCl20.3，K2HPO40.8，KH2PO40.8，酵母浸出物 3，L-甲硫氨酸4，pH值5.0，于30 ℃、150 r·min-1搖床培養(yǎng)24 h。

1.3 方法

1.3.1γ-PGA的提取與純化[13，14]

將納豆芽孢桿菌發(fā)酵液以10 000 r·min-1離心15 min除去菌體；在上清液中加入2 BV乙醇，用玻璃棒攪拌纏繞出γ-PGA；將γ-PGA粗品用去離子水重新溶解后，用1 mol·L-1硫酸調(diào)pH值為2，靜置過(guò)夜至出現(xiàn)白色絮狀沉淀；5000×g離心10 min，收集沉淀，用70％乙醇洗滌，冷凍干燥，即得純化的γ-PGA。

1.3.2 釀酒酵母細(xì)胞SAM的提取及其硫酸鹽的制備

將釀酒酵母發(fā)酵液以5000 r·min-1離心10 min，收集菌體；按150 μL·(g濕酵母)-1加入乙酸乙酯，劇烈攪拌30 min；加入18 mL 0.35 mol·L-1的硫酸，繼續(xù)攪拌1.5 h；5000 r·min-1離心10 min，收集上清液。

將D155樹(shù)脂預(yù)處理成H+型后裝柱(1 cm×60 cm)，用5～8倍柱體積的去離子水洗滌。將上述收集的上清液pH值調(diào)至5.0，流速2 mL·min-1，上樣量為1000 mL。用5倍柱體積的去離子水和0.1 mol·L-1乙酸依次洗脫雜質(zhì)，得SAM；然后用0.35 mol·L-1硫酸以2 mL·min-1的流速洗脫，得到SAM硫酸鹽。在此過(guò)程中用HD 21-2型紫外檢測(cè)儀進(jìn)行監(jiān)測(cè)(A260)，收集主峰。

1.3.3γ-PGA-SAM的制備

將經(jīng)離子交換純化的γ-PGA凍干品用去離子水配成0.02 g·mL-1的溶液。用2 mol·L-1NaOH溶液調(diào)節(jié)SAM硫酸鹽的pH值為4.0，按SAM與γ-PGA中谷氨酸殘基摩爾比為1∶5的比例加入γ-PGA溶液，攪拌1～2 h后，12 000×g離心10 min，在上清中加入2 BV無(wú)水乙醇，低溫(4 ℃)沉淀過(guò)夜。12 000×g離心10 min，收集沉淀物，用無(wú)水乙醇清洗沉淀，干燥，得到γ-PGA-SAM。

1.4 結(jié)構(gòu)表征

1.4.1 高效液相色譜(HPLC)分析

將γ-PGA-SAM凍干品用一定體積的蒸餾水溶解，取1 mL加入2 BV 0.35 mol·L-1硫酸處理2 h，12 000×g離心10 min，取上清液用微孔濾膜過(guò)濾后，用LC-10AT型高效液相色譜儀(島津)進(jìn)行HPLC分析[9]。以經(jīng)相同處理的丁二磺酸腺苷甲硫氨酸為標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照。

色譜條件：VP-ODS色譜柱(Shimadzu Corporation)，流動(dòng)相為0.01 mol·L-1甲酸銨溶液(pH值4.0)，流速1 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。

1.4.2 核磁共振氫譜(1HNMR)分析

γ-PGA-SAM凍干品的氫譜采用預(yù)飽和技術(shù)壓制水峰獲得，由南京高聚物納米復(fù)合材料工程技術(shù)中心完成。

2 結(jié)果與討論

2.1 γ-PGA的提取與純化結(jié)果

從納豆芽孢桿菌發(fā)酵液中提取γ-PGA的收率為9.33 g·L-1。純化的γ-PGA為白色粉狀。SDS-PAGE電泳結(jié)果與文獻(xiàn)[14]相同，平均分子量約為1×106。

2.2 SAM的提取結(jié)果

酵母細(xì)胞破壁處理后的上清液中除了含有SAM，還含有許多雜質(zhì)。離子交換層析后雜質(zhì)明顯減少，分離效果較好，SAM收率為67.5％。

2.3 產(chǎn)物γ-PGA-SAM的表征

2.3.1 HPLC分析

γ-PGA-SAM樣品經(jīng)硫酸處理后進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 γ-PGA-SAM樣品經(jīng)硫酸處理后的HPLC圖譜

HPLC分析發(fā)現(xiàn)，γ-PGA-SAM樣品經(jīng)硫酸處理后的峰形與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品丁二磺酸腺苷甲硫氨酸的峰形(結(jié)果未顯示)一致，說(shuō)明在γ-PGA-SAM的制備過(guò)程中SAM沒(méi)有被破壞。

2.3.21HNMR分析

對(duì)丁二磺酸腺苷甲硫氨酸、γ-PGA樣品以及γ-PGA-SAM樣品進(jìn)行1HNMR分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 丁二磺酸腺苷甲硫氨酸、γ-PGA樣品及γ-PGA-SAM樣品的1HNMR圖譜

由圖2可以看出，丁二磺酸腺苷甲硫氨酸、γ-PGA樣品以及γ-PGA-SAM樣品的1HNMR圖譜中箭頭標(biāo)注的A、B、C、D 4部分發(fā)生了明顯的變化。丁二磺酸腺苷甲硫氨酸分子C處δ4.45、δ4.48歸屬于丁二磺酸腺苷甲硫氨酸分子核糖2、3、4位碳上質(zhì)子的化學(xué)位移，γ-PGA樣品C處δ4.29歸屬于γ-PGA分子α碳上質(zhì)子的化學(xué)位移，γ-PGA-SAM樣品C處的峰并不是兩者的簡(jiǎn)單疊加，而是向高場(chǎng)發(fā)生了移動(dòng)；丁二磺酸腺苷甲硫氨酸分子D處δ2.83歸屬于丁二磺酸腺苷甲硫氨酸分子中與硫相連的甲基上質(zhì)子的化學(xué)位移，具有精細(xì)結(jié)構(gòu)，γ-PGA樣品在D處沒(méi)有峰，而γ-PGA-SAM樣品在D處則表現(xiàn)為一個(gè)寬分布，這是典型的高分子化的特征。

3 結(jié)論

高效液相色譜、核磁共振氫譜分析結(jié)果表明，用γ-聚谷氨酸與S-腺苷甲硫氨酸反應(yīng)制得的產(chǎn)物并不是γ-聚谷氨酸與S-腺苷甲硫氨酸的簡(jiǎn)單混合，而是γ-聚谷氨酸腺苷甲硫氨酸鹽。S-腺苷甲硫氨酸分子中嘌呤環(huán)上的氨基、氨基酸鏈上的氨基以及極性較強(qiáng)的锍基都帶正電荷，可與聚陰離子γ-聚谷氨酸的羧基之間發(fā)生相互作用。制得的γ-聚谷氨酸腺苷甲硫氨酸鹽對(duì)提高S-腺苷甲硫氨酸的穩(wěn)定性具有重要意義。

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