馬曉娟,蔚 萍,妙 亮,邊六交

(西北大學生命科學學院,陜西 西安 710069)

腫瘤的發(fā)生和發(fā)展依賴于新血管的不斷形成，因此抑制新血管形成(Angiogenesis)進而抑制腫瘤的生成已成為治療腫瘤的一個重要靶點[1]。1994年，O′Reilly等[2,3]發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性血管生成抑制劑Angiostatin是由纖溶酶原前4個餅環(huán)區(qū)組成；1997年，Cao等[4]發(fā)現(xiàn)纖溶酶原N端的第5個餅環(huán)區(qū)(Plasminogen kringle 5)同樣具有抑制血管內(nèi)皮細胞增殖和腫瘤生長的能力，而且抑制能力比Angiostatin更強。

血管生長抑制因子Kringle 5是目前發(fā)現(xiàn)的抑制血管內(nèi)皮細胞增殖和腫瘤生長活性最強的纖溶酶原片段，在腫瘤治療方面具有潛在的應用價值和廣闊的市場前景。由于Kringle 5的來源有限，因此利用基因工程技術(shù)發(fā)酵生產(chǎn)重組Kringle 5具有重要的研究和應用價值。邊六交等[5]對融合型血管生長抑制因子Kringle 5的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化；2011年，妙亮等[6]對可溶型非融合血管生長抑制因子Kringle 5進行了克隆表達、分離純化和活性測定。

作者在上述研究的基礎(chǔ)上，通過單因子實驗對已經(jīng)構(gòu)建的表達可溶型非融合血管生長抑制因子Kringle 5的基因工程菌E.coliBL21(DE3) pET15b/K5分別進行發(fā)酵培養(yǎng)基和誘導表達條件的優(yōu)化，擬為Kringle 5的進一步放大生產(chǎn)和臨床應用奠定基礎(chǔ)。

1 實驗

1.1 菌種和質(zhì)粒

宿主菌為大腸桿菌BL21(DE3)；表達質(zhì)粒為攜帶血管生長抑制因子Kringle 5基因的重組質(zhì)粒pET15b/K5；表達可溶型非融合血管生長抑制因子Kringle 5的基因工程菌E.coliBL21(DE3) pET15b/K5(所表達Kringle 5的分子量約為28.0 kD，以三聚體形式存在)為自行構(gòu)建，保存于-70 ℃ 的15％甘油中。

1.2 試劑

蛋白胨、酵母粉，英國OXOID 公司；異丙基硫代-2-β-D-半乳糖苷(IPTG)、氨芐青霉素(Amp)，美國Amresco公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、考馬斯亮藍R250，F(xiàn)luka公司；葡萄糖、NaH2PO4、Na2HPO4、NH4Cl，分析純，西安潤德生物試劑有限公司。

1.3 LB培養(yǎng)基

胰蛋白胨10.0 g·L-1，酵母提取物5.0 g·L-1，NaCl 10.0 g·L-1，調(diào)pH值為7.0。

1.4 菌體干重的測定

取1.5 mL的離心管置于80 ℃恒溫箱中烘干至恒重并稱重(W1);取1 mL菌液加入已烘干至恒重的離心管中，10 000 r·min-1離心1 min，去上清；再加入1 mL蒸餾水，吹吸混勻洗滌菌體，于10 000 r·min-1離心1 min，去上清；置于恒溫箱中烘干至恒重并稱重(W2)。平行測定3次，取平均值。按下式計算菌體干重(DCW)：

式中：V為菌液體積。

1.5 Kringle 5重組蛋白表達量和菌體總蛋白的測定

用常規(guī)SDS-PAGE凝膠電泳檢測、考馬斯亮藍染色后由RS-232C型蛋白核酸分析儀測定Kringle 5表達水平(表達量占菌體總蛋白的百分比)。菌體總蛋白采用Bradford 法[7]測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 培養(yǎng)基組成的優(yōu)化

以LB基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加了葡萄糖、NH4Cl、NaH2PO4和Na2HPO4的半合成培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基，對半合成培養(yǎng)基中的葡萄糖、NH4Cl、NaH2PO4和Na2HPO4濃度進行優(yōu)化。

2.1.1 葡萄糖濃度

取已滅菌的試管編號，分別加入10 mL LB基礎(chǔ)培養(yǎng)基，再添加終濃度(g·L-1)分別為3.0、6.0、8.0、10.0、12.0、15.0的葡萄糖，按1％的接種量在37 ℃、220 r·min-1下?lián)u瓶培養(yǎng)10 h，測定菌體干重，結(jié)果見圖1。

圖1 葡萄糖濃度對菌體生長的影響

由圖1可以看出，隨著葡萄糖濃度的增大，菌體干重先上升后下降；葡萄糖濃度為6.0 g·L-1時，菌體干重達到最大。這可能是因為，一方面培養(yǎng)基中的碳源濃度較高時，細菌的生長速度可能會因細胞脫水而下降；另一方面葡萄糖的代謝會產(chǎn)生乙酸，影響菌體生長[8]，同時，葡萄糖的分解代謝產(chǎn)物可能阻遏某些基因的轉(zhuǎn)錄，所以高濃度的葡萄糖會影響目的蛋白的表達[9]。因此，確定最佳的葡萄糖濃度為6.0 g·L-1。

2.1.2 NH4Cl濃度[10]

分別向10 mL LB基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入終濃度(g·L-1)為1.0、1.4、2.0、2.6、3.0的NH4Cl，按1％的接種量在37 ℃、220 r·min-1下?lián)u瓶培養(yǎng)10 h，測定菌體干重，結(jié)果見圖2。

圖2 NH4Cl濃度對菌體生長的影響

由圖2可以看出，隨著NH4Cl濃度的增大，菌體干重先上升后下降；NH4Cl濃度為2.6 g·L-1時,菌體干重最大。這是因為，過高的鹽離子濃度可能會導致滲透壓的變化，從而影響菌體細胞的生長。因此，確定最佳的NH4Cl濃度為2.6 g·L-1。

2.1.3 NaH2PO4濃度[11]

分別在上述優(yōu)化的LB基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入終濃度(g·L-1)為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0的NaH2PO4，按1％的接種量在37 ℃、220 r·min-1下?lián)u瓶培養(yǎng)10 h，測定菌體干重，結(jié)果見圖3。

圖3 NaH2PO4濃度對菌體生長的影響

由圖3可以看出，NaH2PO4濃度為5.0 g·L-1時，菌體干重達到最大。因此，選擇最佳的NaH2PO4濃度為5.0 g·L-1。

2.1.4 Na2HPO4濃度

分別在上述優(yōu)化的LB基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入終濃度(g·L-1)為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的Na2HPO4，按1％的接種量在37 ℃、220 r·min-1下?lián)u瓶培養(yǎng)10 h，測定菌體干重，結(jié)果見圖4。

圖4 Na2HPO4濃度對菌體生長的影響

由圖4可以看出，Na2HPO4濃度為6.0 g·L-1時，菌體干重達到最大。因此，選擇最佳的Na2HPO4濃度為6.0 g·L-1。

綜合以上結(jié)果，確定優(yōu)化培養(yǎng)基的成分為：胰蛋白胨10.0 g·L-1，酵母提取物5.0 g·L-1，NaCl 10.0 g·L-1，葡萄糖6.0 g·L-1，NH4Cl 2.6 g·L-1，NaH2PO45.0 g·L-1，Na2HPO46.0 g·L-1。

2.2 生長曲線的測定

采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基，將種子液接入裝液量12 mL的試管中進行培養(yǎng)，每小時取樣一次，以基礎(chǔ)LB培養(yǎng)基為對照，測定菌體干重，確定基因工程菌的對數(shù)生長期，結(jié)果見圖5。

圖5 基因工程菌在優(yōu)化培養(yǎng)基與LB基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的生長曲線對比

由圖5可以看出，優(yōu)化培養(yǎng)基中菌體的生長速率和生物量都有了很大的提高，明顯比LB基礎(chǔ)培養(yǎng)基更適合基因工程菌的生長；對數(shù)生長后期在4 h左右。因此，確定誘導劑添加時間為接種后4 h。

2.3 誘導表達條件的優(yōu)化

在優(yōu)化培養(yǎng)基中，按1％的接種量進行搖瓶發(fā)酵，在接種后4 h添加誘導劑，優(yōu)化誘導表達條件。

2.3.1 誘導劑濃度

分別添加終濃度(mmol·L-1)為0.0001、0.001、0.01、0.1、0.5、1.0、2.0的IPTG，在37 ℃、220 r·min-1下誘導培養(yǎng)5 h后，各取1 mL菌體離心，去上清，用SDS-PAGE電泳測定Kringle 5表達水平；再各取1 mL菌體離心，去上清，測定菌體干重。結(jié)果見圖6。

1.蛋白Marker 2.未誘導對照 3～9.IPTG濃度(mmol·L-1)：0.0001，0.001，0.01，0.1，0.5，1.0，2.0

圖6 誘導劑濃度對菌體生長和Kringle 5表達的影響

由圖6可以看出，當IPTG濃度為0.01 mmol·L-1時，菌體生物量達到最大，目的蛋白表達水平也最高，為20％；之后再增大誘導劑濃度，目的蛋白的表達水平不再升高。因此，確定IPTG濃度為0.01 mmol·L-1。

2.3.2 誘導時間

加入0.01 mmol·L-1誘導劑后，分別在37 ℃、220 r·min-1下誘導1 h、2 h、4 h、6 h、8 h和10 h，取1 mL菌體離心，去上清，用SDS-PAGE電泳測定Kringle 5表達水平；再各取1 mL菌體離心，去上清，測定菌體干重。結(jié)果見圖7。

1.蛋白Marker 2.未誘導對照 3～8.誘導時間(h):1,2,4,6,8,10

圖7 誘導時間對菌體生長和Kringle 5表達的影響

由圖7可以看出，誘導4～6 h后，目的蛋白的表達水平已趨于穩(wěn)定，約為20％；誘導6 h后，菌體干重也趨于穩(wěn)定。因此，確定誘導時間為6 h。

2.3.3 誘導溫度

加入0.01 mmol·L-1誘導劑，分別在15 ℃、25 ℃、30 ℃和37 ℃下于220 r·min-1誘導6 h，誘導結(jié)束后各取1 mL菌體離心，去上清，用SDS-PAGE電泳測定Kringle 5表達水平；再各取1 mL菌體離心，去上清，測定菌體干重。結(jié)果見圖8。

1.蛋白Marker 2.未誘導對照 3～6.誘導溫度(℃)：15，25，30，37

圖8 誘導溫度對菌體生長和Kringle 5表達的影響

由圖8可以看出，在30 ℃和37 ℃下目的蛋白表達水平已趨于穩(wěn)定，約為20％；而37 ℃時更有利于菌體生長。因此，確定誘導溫度為37 ℃。

2.3.4 搖床轉(zhuǎn)速

加入0.01 mmol·L-1誘導劑，分別在轉(zhuǎn)速180 r·min-1、220 r·min-1、260 r·min-1下于37 ℃誘導培養(yǎng)6 h，誘導結(jié)束后各取1 mL菌體離心，去上清，用SDS-PAGE電泳測定Kringle 5表達水平；再各取1 mL菌體離心，去上清，測定菌體干重。結(jié)果見圖9。

1.蛋白Marker 2.未誘導對照 3～5.搖床轉(zhuǎn)速(r·min-1)：180，220，260

由圖9可以看出，目的蛋白Kringle 5的表達水平穩(wěn)定在20％左右，搖床轉(zhuǎn)速對其影響不大；搖床轉(zhuǎn)速為180 r·min-1時，菌體生物量較低，單位體積培養(yǎng)液得到的目的蛋白表達總量會處于較低的水平；而當搖床轉(zhuǎn)速為260 r·min-1時，菌體干重和表達水平的提高均不明顯，同時，搖床運轉(zhuǎn)的動力成本和此過程中的不利產(chǎn)熱均使其不宜作為最優(yōu)條件。因此，確定搖床轉(zhuǎn)速為220 r·min-1。

2.4 優(yōu)化培養(yǎng)基與LB基礎(chǔ)培養(yǎng)中目的蛋白表達量的比較

將基因工程菌E.coliBL21(DE3)pET15b/K5分別置于優(yōu)化培養(yǎng)基和LB基礎(chǔ)培養(yǎng)基中于優(yōu)化發(fā)酵條件下?lián)u床培養(yǎng)，2種培養(yǎng)基中Kringle 5表達的SDS-PAGE分析和比較見圖10、表1。

1.蛋白Marker 2.LB基礎(chǔ)培養(yǎng)基 3.優(yōu)化培養(yǎng)基

表1 優(yōu)化培養(yǎng)基和LB基礎(chǔ)培養(yǎng)基中Kringle 5表達的比較

由圖10、表1可以看出，優(yōu)化培養(yǎng)基與LB基礎(chǔ)培養(yǎng)基相比，生物量和Kringle 5表達量都獲得了很大提高，其中表達量提高了1.18倍。

3 結(jié)論

對基因工程菌E.coliBL21(DE3) pET15b/K5發(fā)酵產(chǎn)可溶型非融合血管生長抑制因子Kringle 5的培養(yǎng)基和誘導表達條件進行了優(yōu)化，確定最佳培養(yǎng)基(g·L-1)為：胰蛋白胨10.0，酵母提取物5.0，NaCl 10.0，葡

萄糖6.0，NH4Cl 2.6，NaH2PO45.0，Na2HPO46.0;確定最佳誘導表達條件為：誘導劑濃度0.01 mmol·L-1，誘導時間6 h，誘導溫度37 ℃，搖床轉(zhuǎn)速220 r·min-1。在此條件下，菌體干重為1.8 g·L-1，Kringle 5表達量為360 mg·L-1，占菌體總蛋白的20％，與LB基礎(chǔ)培養(yǎng)基相比，Kringle 5表達量提高了1.18倍。

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