苑莉莉，劉 雄，張業(yè)中，戴 捷

(長江大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 荊州 434023)

喜樹堿(Camptothecin,CPT)是從珙桐科植物喜樹的樹干、樹皮和果實(shí)中提取的一種具有抗腫瘤作用的生物堿[1，2]，羥喜樹堿(10-Hydroxycamptothecin，HCPT)是將喜樹堿基本環(huán)A環(huán)中9位的-H由-OH取代而成。體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均顯示HCPT比CPT有更強(qiáng)的抗腫瘤作用和更寬的抗瘤譜，且毒性較低，在同類抗腫瘤單體中活性最強(qiáng)[3，4]。HCPT的獨(dú)特作用位點(diǎn)使其具有專一性強(qiáng)、對(duì)正常組織影響小、藥性與其它常用抗癌藥物無交叉耐藥性的特點(diǎn)，臨床上已經(jīng)被廣泛應(yīng)用。

血清白蛋白是循環(huán)系統(tǒng)中含量最豐富的可溶性載體蛋白，它可以與許多內(nèi)源及外源性物質(zhì)結(jié)合起到存儲(chǔ)與轉(zhuǎn)運(yùn)作用，是生物體內(nèi)重要的藥物小分子結(jié)合蛋白[5]?？紤]到HCPT的活性與重要的醫(yī)療價(jià)值，研究其與血清白蛋白的相互作用，不僅有助于了解HCPT在生物體內(nèi)的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝，而且有助于認(rèn)識(shí)其藥物作用的藥效和藥理，為新藥研發(fā)及臨床用藥提供參考。

作者在此利用多種光譜技術(shù),在模擬人體生理?xiàng)l件下，研究HCPT與牛血清白蛋白(BSA)的相互作用。利用熒光光譜法，計(jì)算其猝滅常數(shù)和結(jié)合常數(shù)，并從分子水平探討其猝滅機(jī)制和結(jié)合模式；利用三維熒光光譜和圓二色譜(CD)探討HCPT對(duì)BSA構(gòu)象的影響。對(duì)進(jìn)一步獲取蛋白質(zhì)的構(gòu)象、結(jié)構(gòu)，了解藥物在人體內(nèi)的儲(chǔ)存、運(yùn)輸、吸收、分布等過程有著重大意義。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

HCPT溶液(1.0×10-3mol·L-1)，中國藥品生物制品檢定所；BSA(2.0×10-6mol·L-1)，Sigma公司；NaOH溶液；pH值為7.40的Tris-HCl緩沖溶液；所用試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水，經(jīng)檢驗(yàn)均無熒光雜質(zhì)。

LS-55型熒光分光光度計(jì)，美國Perkin公司；J-810型圓二色譜儀，Jasco,Tokyo，Japan；AY-120M型電子分析天平，日本島津公司；SYC-15型超級(jí)恒溫水浴(控溫精度±0.1 ℃)，南京桑力電子設(shè)備廠。

1.2 方法

1.2.1 熒光猝滅光譜

設(shè)定激發(fā)波長λex為285 nm、激發(fā)狹縫寬度為15.0 nm、發(fā)射狹縫寬度為4.0 nm，在模擬人體生理?xiàng)l件下測定不同溫度下(298 K、304 K和310 K)不同濃度的HCPT溶液與BSA相互作用的熒光猝滅光譜，記錄波長300～450 nm范圍內(nèi)的熒光光譜。

1.2.2 圓二色譜(CD)

用圓二色譜儀測定室溫時(shí)的CD光譜。參數(shù)如下：比色杯光路長為0.1 cm，掃描速度為200 nm·min-1,在pH值為7.40的持續(xù)氮流條件下測定200～260 nm波長范圍內(nèi)BSA與HCPT作用前后的CD光譜。圓二色譜由Jasco′s Spectra Manager MT軟件控制。不改變實(shí)驗(yàn)條件，以緩沖溶液代替HCPT作為空白對(duì)照。

1.2.3 三維熒光光譜

用熒光分光光度計(jì)測量BSA和HCPT-BSA的三維熒光光譜。設(shè)置初始激發(fā)波長為200 nm，在200～350 nm之間每隔5 nm記錄1次，共掃描31次，其它參數(shù)與熒光光譜相同。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光光譜

蛋白質(zhì)中因含有色氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸殘基而發(fā)射較強(qiáng)的內(nèi)源熒光[6]。圖1是不同濃度的HCPT對(duì)BSA的熒光猝滅光譜。

T=298 K;λex=285 nm;c(BSA)=2.0×10-6mol·L-1；c(HCPT)，A～I(xiàn)(×10-6 mol·L-1)：0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0；L為HCPT的激發(fā)光譜，c(HCPT)=1.0×10-6 mol·L-1

由圖1可看出，當(dāng)激發(fā)波長為285 nm時(shí)，BSA在350 nm處有一個(gè)強(qiáng)的熒光發(fā)射峰，而HCPT卻沒有任何內(nèi)源熒光；隨著 HCPT濃度的增大，BSA的內(nèi)源熒光強(qiáng)度有規(guī)律地降低,表明HCPT能猝滅BSA的內(nèi)源熒光。由圖1還可以看出，最大發(fā)射波長有明顯的藍(lán)移現(xiàn)象，并且在415 nm處有一個(gè)等發(fā)射點(diǎn)，表明蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生了改變，色氨酸殘基周圍環(huán)境的極性減弱，疏水作用力增強(qiáng)。

2.2 熒光猝滅機(jī)制

熒光猝滅過程可分為動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅，可以從溫度對(duì)猝滅常數(shù)的影響、猝滅劑對(duì)熒光物質(zhì)的吸收光譜的影響和熒光壽命等方面加以區(qū)分。研究表明，動(dòng)態(tài)猝滅過程的猝滅常數(shù)隨溫度升高而增大；而靜態(tài)猝滅過程的猝滅常數(shù)隨溫度升高而減小。

本實(shí)驗(yàn)利用溫度對(duì)猝滅常數(shù)的影響來判斷猝滅機(jī)制。

不同溫度下，HCPT對(duì)BSA的熒光猝滅的Stern-Volmer關(guān)系見圖2。

圖2 不同溫度下pH=7.40時(shí)，HCPT對(duì)BSA熒光猝滅的Stern-Volmer關(guān)系圖

為了判斷HCPT-BSA體系的猝滅機(jī)制，用經(jīng)典Stern-Volmer方程[7]分析3個(gè)不同溫度(298 K、304 K、310 K)下的熒光猝滅數(shù)據(jù)：

F0/F=1+KSVcq=1+Kqτ0cq

(1)

式中:F和F0分別為有無猝滅劑時(shí)體系中熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度；KSV為Stern-Volmer猝滅常數(shù)；cq為猝滅劑的濃度；Kq為生物大分子的猝滅速率常數(shù)；τ0為生物大分子內(nèi)源性熒光壽命，其值為10-8s。應(yīng)用式(1)計(jì)算3個(gè)溫度下的猝滅常數(shù)，結(jié)果見表1。

表1 不同溫度下，HCPT與BSA相互作用的Stern-Volmer猝滅常數(shù)

由表1可知，猝滅常數(shù)KSV隨溫度的升高而減小，Kq值遠(yuǎn)大于生物大分子的最大分散碰撞猝滅常數(shù)(2.0×1010L·mol-1·s-1)。因此,初步判斷其猝滅機(jī)制為靜態(tài)猝滅。

為了進(jìn)一步研究其猝滅機(jī)制，用修正的Stern-Volmer方程[8]來處理猝滅數(shù)據(jù)：

F0/(F0-F)=1/(faKacq)+1/fa

(2)

修正Stern-Volmer方程的表觀結(jié)合常數(shù)Ka見表2。

由表2可以看出，Ka隨溫度的變化趨勢與KSV一致，表明HCPT確實(shí)與BSA結(jié)合生成了HCPT-BSA復(fù)合物。

圖3 不同溫度下pH=7.40時(shí)，HCPT對(duì)BSA熒光猝滅的修正的Stern-Volmer關(guān)系圖

表2 修正Stern-Volmer方程的表觀結(jié)合常數(shù)Ka和HCPT-BSA體系的相關(guān)熱力學(xué)參數(shù)

2.3 HCPT與BSA作用力類型的判斷

活性小分子和生物大分子之間的相互作用力包括氫鍵、靜電引力、范德華力、疏水作用力4種[9]。假設(shè)在測定溫度范圍內(nèi)焓變(ΔHθ)變化不大，可視為常數(shù)，則它的值和熵變(ΔSθ)可以從 Van′t Hoff方程求得：

lnK=-ΔHθ/RT+ΔSθ/R

(3)

式中：K為相應(yīng)溫度下的結(jié)合常數(shù)；R為氣體常數(shù)；ΔHθ和ΔSθ可以分別從圖4的斜率和截距中得出。

圖4 HCPT和BSA相互作用的Van′t Hoff曲線(pH=7.40)

自由能變(ΔGθ)由下式計(jì)算：

ΔGθ=ΔHθ-TΔSθ

(4)

ΔGθ、ΔHθ、ΔSθ的計(jì)算結(jié)果見表2。

Ross等根據(jù)大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,總結(jié)了判斷生物大分子與小分子相互作用力類型的熱力學(xué)規(guī)律,即疏水作用力使體系的ΔHθ和ΔSθ為正,氫鍵或范德華力使體系的ΔHθ和ΔSθ為負(fù)[10]。由表2中的ΔHθ(-35.91 kJ·mol-1)和ΔSθ(-24.30 J·mol-1·K-1)可知，結(jié)合過程的作用力類型主要為氫鍵和范德華力，同時(shí)疏水作用力也不能忽略。

2.4 HCPT對(duì)BSA構(gòu)象的影響

2.4.1 CD光譜

CD光譜是研究稀溶液中蛋白質(zhì)構(gòu)象的一種快速、簡單且較準(zhǔn)確的方法。為了研究HCPT對(duì)BSA構(gòu)象的影響，測定了室溫條件下BSA和HCPT-BSA體系的CD光譜，結(jié)果見圖5。

c(BSA)=2.0×10-6 mol·L-1；c(HCPT)，A～C(×10-6 mol·L-1):0、4.0、12.0

由圖5可以看出，BSA的α-螺旋結(jié)構(gòu)在208 nm和222 nm的紫外區(qū)出現(xiàn)2個(gè)負(fù)的特征肩峰譜帶，隨著HCPT的加入，BSA峰強(qiáng)度明顯減小，但是峰的形狀和峰高沒有發(fā)生改變。這表明，HCPT的存在對(duì)BSA二級(jí)結(jié)構(gòu)有一定的影響，但α-螺旋結(jié)構(gòu)依然占主導(dǎo)地位。

為了定量分析BSA中不同二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量，用SELCON3算法分析CD光譜，結(jié)果見表3[11]。

由表3可知，在游離態(tài)的BSA中，α-螺旋結(jié)構(gòu)(規(guī)則的α-螺旋和不規(guī)則的α-螺旋)的含量為60.7％；但當(dāng)BSA與HCPT的摩爾比達(dá)到1∶6時(shí)，BSA中α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量降至55.8％。這表明HCPT與BSA多肽鏈氨基酸殘基的結(jié)合，破壞了BSA多肽鏈上的氫鍵，導(dǎo)致肽鏈變得疏松[12]。

表3 SELCON3計(jì)算的BSA中不同二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量/％

2.4.2 三維熒光光譜

三維熒光光譜是近20年發(fā)展起來的熒光分析新技術(shù)。此分析方法不僅可以提高測量靈敏度和對(duì)分子結(jié)構(gòu)的選擇性，而且能夠更全面地展現(xiàn)待測樣品的熒光信息和構(gòu)型變化特征。圖6和表4分別是BSA和HCPT-BSA體系的三維熒光光譜及數(shù)據(jù)分析。

c(BSA)=2.0×10-6 mol·L-1;c(HCPT)，A～B(×10-6 mol·L-1)：0，2.0

表4 BSA 和 HCPT-BSA體系的三維熒光光譜的特性參數(shù)

由圖6和表4可以看出：峰a是瑞利散射峰(λex=λem)[13]，隨著HCPT的加入，峰強(qiáng)度減弱，可能是由于HCPT在BSA表面結(jié)合后,破壞了BSA表面的保護(hù)水層,使原來較為分散的BSA更加分散,引起B(yǎng)SA粒徑減小,導(dǎo)致共振散射強(qiáng)度下降。峰b是二級(jí)散射峰(λem=2λex)[14]。峰1(λex=285.0 nm,λem=351.0 nm)顯示了色氨酸和酪氨酸殘基的光譜行為，其最大發(fā)射波長和熒光強(qiáng)度與微環(huán)境的極性密切相關(guān)，是研究熒光猝滅時(shí)的主熒光峰。此外，除了峰1，還有一個(gè)新的強(qiáng)熒光峰——峰2(λex=230.0 nm,λem=351.0 nm)，該峰的激發(fā)波長為230.0 nm，在CD光譜圖中，由于多肽鏈的α-螺旋的n→π*能量躍遷在208 nm和222 nm出現(xiàn)了2個(gè)負(fù)峰，所以推測峰2主要顯示了多肽主鏈結(jié)構(gòu)的熒光性質(zhì)。分析加入HCPT前后峰1和峰2的強(qiáng)度變化，發(fā)現(xiàn)其熒光強(qiáng)度都明顯猝滅但猝滅的程度不同，峰1的強(qiáng)度猝滅了26.8％,而峰2的強(qiáng)度猝滅了34.6％。

綜合三維熒光光譜和CD光譜的結(jié)果，得出以下結(jié)論，HCPT與BSA的相互作用改變了蛋白質(zhì)的有序結(jié)構(gòu)和疏水腔內(nèi)的微環(huán)境[15]。

3 結(jié)論

在模擬人體生理?xiàng)l件下，測定了不同溫度下HCPT對(duì)BSA的熒光猝滅光譜，根據(jù)相關(guān)理論判斷出該反應(yīng)為形成復(fù)合物的靜態(tài)猝滅過程。并由相關(guān)的熱力學(xué)公式，求得不同溫度下的熱力學(xué)參數(shù)，由計(jì)算所得到的數(shù)據(jù)及相關(guān)的判別理論，推測出氫鍵和范德華力為維持復(fù)合物穩(wěn)定的主要作用力類型，同時(shí)疏水作用力也不能忽略。通過室溫條件下的圓二色譜和三維熒光光譜分析，發(fā)現(xiàn)在加入HCPT后，BSA的α-螺旋含量減少，進(jìn)一步說明其二級(jí)結(jié)構(gòu)和微環(huán)境發(fā)生了改變。

參考文獻(xiàn)：

[1] Garcia-Carbonero R，Supko J G.Current perspectives on the clinical experience，pharmacology，and continued development of the camptothecins[J].Clinical Cancer Research，2002，8(3)：641-661.

[2] Zhou Y Y，Du Y Z，Wang L，et al.Preparation and pharmacodynamics of stearic acid and poly(lactic-co-glycolic acid) grafted chitosan oligosaccharide micelles for 10-hydroxycamptothecin[J].International Journal of Pharmaceutics，2010，393(1-2):143-151.

[3] Liu K H，Ding X W，Deng B W，et al.10-Hydroxycamptothecin produced by a new endophyticXylariasp.，M20，fromCamptothecaacuminata[J].Biotechnology Letters,2010，32(5):689-693.

[4] Shweta S，Zuehlke S，Ramesha B T，et al.Endophytic fungal st-rains ofFusariumsolani，fromApodytesdimidiataE.Mey.ex Arn(Icacinaceae) produce camptothecin，10-hydroxycamptothecin and 9-methoxycamptothecin[J].Phytochemistry，2010，71(1):117-122.

[5] Hu Y J，Ou-Yang Y，Bai A M，et al.Investigation of the interaction between ofloxacin and bovine serum albumin:Spectroscopic approach[J].Journal of Solution Chemistry，2010,39(5)：709-717.

[6] 張敏，彭毛，李小平，等.光譜法研究蛋白質(zhì)與膽紅素及銅的相互作用[J].化學(xué)與生物工程，2007，24(3):27-30.

[7] Wang T H，Zhao Z M，Wei B Z,et al.Spectroscopic investigations on the binding of dibazol to bovine serum albumin[J].Journal of Molecular Structure,2010，970(1-3):128-133.

[8] 朱鏗,童沈陽.熒光黃與蛋白質(zhì)相互作用的研究[J].高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)，1996，17(4)：539-542.

[9] 賈文志,孫紹發(fā).光譜法研究一種喹唑啉酮衍生物與牛血清白蛋白的相互作用[J].化學(xué)世界，2009，50(1)：4-14.

[10] 謝郢,李永成,楊立云,等.替加氟與牛血清白蛋白相互作用的研究[J].化學(xué)與生物工程，2010，27(9):48-52.

[11] Zhang Y Z，Zhou B，Zhang X P,et al.Interaction of malachite green with bovine serum albumin：Determination of the binding mechanism and binding site by spectroscopic methods[J].Journal of Hazardous Materials,2009，163(2-3):1345-1352.

[12] Xu X Y，Sun X J，Liu M,et al.Study on the thermodynamic behavior of betaxolol-bovine serum albumin interacting system[J].Thermochimica Acta,2010，501(1-2):46-49.

[13] Li X Y.Study on the interaction of metronidazole with bovine serum albumin by using fluorescence and resonance lalyeigh light scattering spectrum[J].Acta Physico-Chimica Sinica，2007，23(2):262-267.

[14] 李曉燕.用熒光光譜和共振光散射光譜研究甲硝唑與牛血清白蛋白的相互作用[J].物理化學(xué)學(xué)報(bào)，2007，23(2)：262-267.

[15] He W Y，Li Y，Xue C X，et al.Effect of Chinese medicine alpinetin on the structure of human serum albumin[J].Bioorganic & Medicinal Chemistry，2005，13(5):1837-1845.