余麗麗，姚 琳，楊黎燕，李仲謹

(1.西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，陜西 西安 710021；2.陜西科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，陜西 西安 710021)

1952年Chargaff發(fā)現(xiàn)了堿基互補配對原理，1953年Watson和Crick在此基礎(chǔ)上提出了DNA雙螺旋模型，這兩大發(fā)現(xiàn)既是生物分子識別史上最重大的發(fā)現(xiàn)，又是核酸分子熒光探針分子信標(biāo)(Molecular beacon，MB)的理論基礎(chǔ)。許多分子生物學(xué)和核酸化學(xué)合成的研究突破都得益于MB的發(fā)展，從20世紀(jì)60年代初至今，MB已被廣泛地應(yīng)用于生物、藥物、化學(xué)等多個領(lǐng)域[1～3]。近年來，MB特別是基于DNA結(jié)構(gòu)的MB，已成為一種重要工具，用于核酸的復(fù)制、重組、翻譯和表達的研究。為了滿足后基因組時代的發(fā)展需求，人們通過各種分子工程策略，發(fā)展了許多敏銳性更高、選擇性更優(yōu)的MB。

作者在此對MB的結(jié)構(gòu)、設(shè)計原理、熱力學(xué)研究、選擇性與動力學(xué)研究進行了綜述，并對非典型MB(LNA-MB、SQ-MB)進行了介紹。

1 MB的結(jié)構(gòu)

1996年，Tyagi和Kramer首次共同提出了MB的概念。MB是一種單鏈寡核苷酸探針，具有獨特的莖環(huán)狀(也稱發(fā)夾型)結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)一般包括4個部分：(1)環(huán)狀區(qū)(Loop)：一段長度為15～30個堿基的目標(biāo)識別區(qū)域，可與待測核酸序列互補配對，達到識別的目的；(2)莖干區(qū)(Stem)：兩段長度為5～8個堿基的互補序列；(3)熒光基團：一般連接在MB的5′-端，常見的熒光基團是熒光素(Fluoresein)；(4)猝滅基團：連接在MB的3′-端，常見的猝滅基團有Dabcyl、BHQ-1和BHQ-2(圖1)，基于以上猝滅基團的猝滅效率在85％～97％之間。

圖1 常見的熒光猝滅基團

2 MB的設(shè)計原理

在沒有檢測序列時，MB構(gòu)成一個莖-環(huán)結(jié)構(gòu)(Stem-Loop)，熒光基團和猝滅基團彼此緊鄰，熒光基團將外界給予的大部分能量傳遞給猝滅基團，猝滅基團吸收能量后以熱的形式散發(fā)；少部分未被猝滅基團吸收的能量通過發(fā)射熒光釋放，此過程即為熒光共振能量傳遞(Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)[4～6]，常將此時的結(jié)構(gòu)稱為發(fā)夾結(jié)構(gòu)，如圖2所示。

圖2 MB的設(shè)計原理

在檢測序列時，MB的發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開，猝滅基團與熒光基團有效分離，熒光得以恢復(fù)，Loop段與檢測序列形成比發(fā)夾結(jié)構(gòu)中的Stem雙螺旋結(jié)構(gòu)更長、更穩(wěn)定的雜交雙螺旋結(jié)構(gòu)。

大多數(shù)MB的設(shè)計都基于FRET，該情況下大量的能量傳遞都不以光的形式釋放，而是通過非輻射途徑——熱的形式釋放，有效地提高了猝滅效率，降低了背景噪音。

3 MB的熱力學(xué)研究

大部分情況下，MB與目標(biāo)分子的雜交可以用熱力學(xué)系統(tǒng)解釋。一個簡單的開/關(guān)模型可近似描述反應(yīng)的最初和最終狀態(tài)。該模型可通過實驗數(shù)據(jù)支持：當(dāng)MB與檢測序列完全互補時，形成的雙螺旋結(jié)構(gòu)解旋溫度(T0)為42 ℃；而當(dāng)檢測序列中有1個堿基錯配時，形成的雙螺旋結(jié)構(gòu)解旋溫度(Tm)在28～31 ℃之間。該模型描述了檢測序列中1個堿基錯配對檢測序列與MB形成的雙螺旋結(jié)構(gòu)Tm的影響：錯配堿基位置與Loop中心區(qū)域越接近，對Tm的影響越大，Tm與T0的差距也越大[7～9]。

MB和線性DNA/RNA探針在熱力學(xué)上的研究不僅說明了Tm和選擇性之間的關(guān)系，同時也解釋了為什么MB比線性DNA/RNA探針的選擇性更強。首先，線性DNA/RNA探針有2種可能存在的狀態(tài)：自由態(tài)、與檢測序列互補形成雙螺旋結(jié)構(gòu)[10]；而MB有3種可能存在的狀態(tài)：與檢測序列雜交形成雙螺旋結(jié)構(gòu)(Phase 1)、發(fā)夾結(jié)構(gòu)(Phase 2)、隨機盤繞結(jié)構(gòu)(Phase 3)，如圖3所示。

圖3 MB在體系中的3種不同狀態(tài)

MB的選擇性取決于完全互補的檢測序列-MB形成的雙螺旋結(jié)構(gòu)的解旋溫度(T0)與1個堿基錯配的檢測序列-MB形成的雙螺旋結(jié)構(gòu)的解旋溫度(Tm)的差異性。熱力學(xué)研究表明，MB在發(fā)夾結(jié)構(gòu)的自由能低于在隨機盤繞結(jié)構(gòu)的自由能[7,8,10～13]，這意味著，雜交最易發(fā)生在溫度改變引起的雙螺旋結(jié)構(gòu)相變到發(fā)夾結(jié)構(gòu)過程中，而未過渡到隨機盤繞結(jié)構(gòu)之前。Stem螺旋結(jié)構(gòu)越長，完全配對的雙螺旋結(jié)構(gòu)和含錯配堿基的雙螺旋結(jié)構(gòu)的解旋溫度差別越大，MB的結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定、選擇性越優(yōu)。

4 MB的選擇性與動力學(xué)研究

相對于線性DNA/RNA探針，MB表現(xiàn)出較優(yōu)的選擇性，這得益于MB的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，此外，MB還可通過優(yōu)化序列提高它的選擇性[8，14]。熱力學(xué)研究表明，通過增加Stem的長度和穩(wěn)定性可以有效地提高選擇性，而提高選擇性的最簡單方法則是增加Stem序列中G、C的含量。但是，隨著MB中Stem螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的提高，它的雜交速率會有所減慢。線性DNA探針長度為17～19個堿基時，它的雜交速率常數(shù)在1×104L·mol-1·s-1左右；但是MB的Stem長度從4個堿基增加到6個堿基時，雜交速率常數(shù)從5000 L·mol-1·s-1降到40～300 L·mol-1·s-1[8]，如圖4所示。

圖4 雜交速率與Stem長度的關(guān)系

Stem序列長度縮短，會導(dǎo)致背景噪音的增大和選擇性的下降。通常來說，Stem序列長度在5～7個堿基之間、Loop長度在15～25個堿基之間，能使選擇性和雜交速率常數(shù)都維持在可接受范圍。因此，平衡Stem序列長度縮短帶來的選擇性降低和Stem序列長度增長帶來的雜交速率常數(shù)降低這二者的矛盾，是研究者面臨的一個挑戰(zhàn)。其中一種策略是使用更長的Stem序列(Stem序列包含與目標(biāo)序列結(jié)合的Loop序列部分)，該方法可以實現(xiàn)雜交速率的加快，且不需犧牲特殊增長的Stem序列。

選擇性與雜交速率的矛盾還受溫度的影響。在MB的實際應(yīng)用中，溫度是一個重要的外在影響因素。較高的溫度會使自由的MB從發(fā)夾結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變到隨機盤繞結(jié)構(gòu)，在隨機盤繞結(jié)構(gòu)時，MB的熒光恢復(fù)，帶來背景噪音。實際應(yīng)用過程(如活體成像、即時PCR檢測)中，溫度一般高于25 ℃。當(dāng)溫度高于50 ℃時，發(fā)夾結(jié)構(gòu)開始轉(zhuǎn)變到隨機盤繞結(jié)構(gòu)，此時，它們作為無效的MB同時還引入較高的背景噪音[8,10]。因此，MB需要穩(wěn)定的Stem結(jié)構(gòu)以減少被檢測到的背景噪音熒光[4，15]。現(xiàn)階段，已經(jīng)發(fā)展了一些新型的溫度穩(wěn)定型Stem系統(tǒng)解決了這個問題。

5 非典型MB介紹

5.1 鎖核酸分子探針(LNA-MB)

為解決溫度過高引起發(fā)夾結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)殡S機盤繞結(jié)構(gòu)而引起較高的背景噪音的問題，研究人員合成了鎖核酸(Locked nucleic acid，LNA)MB。LNA中的核糖是一個雙環(huán)呋喃糖結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)使得堿基與核糖之間的鏈接鍵不能隨意轉(zhuǎn)動，分子的穩(wěn)定性更高(圖 5)。而且LNA-DNA雜交能力比DNA-DNA雜交能力更強[16～18]，所以LNA-MB的選擇性也明顯強于DNA-MB。在95 ℃時，RNA或DNA都已經(jīng)發(fā)生變性，但LNA-MB能夠保持穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，且LNA-MB與目標(biāo)DNA仍能保持雜交狀態(tài)。因此，LNA-MB被廣泛應(yīng)用于普通DNA-MB不適用的高溫生物學(xué)研究。

圖5 LNA-MB的結(jié)構(gòu)

5.2 超級猝滅基團分子探針(SQ-MB)

SQ-MB是一個一端具有多個猝滅基團的熒光分子探針，如圖6所示。

圖6 包含有3個猝滅基團的SQ-MB

近年來，MB被廣泛地應(yīng)用于生物技術(shù)研究的各個領(lǐng)域。但由于MB結(jié)構(gòu)中的熒光基團不能被有效地猝滅，較高的背景噪音嚴(yán)重影響了實際應(yīng)用過程中測試結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，通過結(jié)構(gòu)的優(yōu)化以降低體系的背景噪音越來越受到關(guān)注。據(jù)報道，應(yīng)用多個猝滅基團與一個熒光基團配對，可以有效地提高猝滅效率。這是由于多個猝滅基團可以提高吸收效率、增強猝滅基團與熒光基團間的偶極-偶極配位能力，從而提高猝滅效率[17]。

6 結(jié)語

MB是近幾年發(fā)展起來的一種新型檢測技術(shù)，具有高靈敏度、高選擇性等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、生化分析等諸多領(lǐng)域。今后，MB的主要發(fā)展方向為：(1)其它形態(tài)(如啞鈴型)MB的設(shè)計合成和研究；(2)三螺旋結(jié)構(gòu)的MB的探討研究；(3)通過猝滅基團的設(shè)計和研究，以降低背景噪音。

參考文獻：

[1] Hall B D，Spiegelman S.Sequence complementarity of T2-DNA and T2-specific RNA[J].Natl Acad Sci USA，1961，47(2)：137-146.

[2] Ahn S H，Kramvis A，Kawai S，et al.Sequence variation upstream of precore translation initiation codon reduces hepatitis B virus e antigen production[J].Gastroenterology，2003，125(5)：1370-1378.

[3] Nygaard A P，Hall B D.A method for the detection of RNA-DNA complexes[J].Biochem Biophys Res Commun，1963，12：98-104.

[4] Tyagi S，Kramer F R.Molecular beacons：Probes that fluoresce upon hybridization[J].Nat Biotechnol，1996，14(3)：303-308.

[5] Fang X H，Li J W J，Perlette J，et al.Molecular beacons:Novel fluorescent probes[J].Anal Chem，2000，72(23)：747A-753A.

[6] Tan W H，Wang K M，Drake T J.Molecular beacons[J].Curr Opin Chem Biol，2004，8(5)：547-553.

[7] Bratu D P，Cha B J，Mhlanga M M，et al.Visualizing the distribution and transport of mRNAs in living cells[J].Natl Acad Sci USA，2003，100(23)：13308-13313.

[8] Tsourkas A，Behlke M A，Rose S D，et al.Hybridization kinetics and thermodynamics of molecular beacons[J].Nucleic Acids Res，2003，31(4)：1319-1330.

[9] Tsourkas A，Behlke M A，Bao G.Structure-function relationships of shared-stem and conventional molecular beacons[J].Nucleic Acids Res,2002，30(19):4208-4215.

[10] Bonnet G，Tyagi S，Libchaber A，et al.Thermodynamic basis of the enhanced specificity of structured DNA probes[J].Proc Natl Acad Sci USA，1999，96(11)：6171-6176.

[11] Tyagi S，Marras S A E，Kramer F R.Wavelength-shifting molecular beacons[J].Nat Biotechnol，2000，18(11)：1191-1196.

[12] Tyagi S，Bratu D P，Kramer F R.Multicolor molecular beacons for allele discrimination[J].Nat Biotechnol，1998，16(1)：49-63.

[13] Tan L，Li Y，Drake T J，et al.Molecular beacons for bioanalytical applications[J].Analyst，2005，130(7)：1002-1005.

[14] Goel G，Kumar A，Puniya A K，et al.Molecular beacon：A multitask probe[J].J Appl Microbiol，2005，99(3)：435-442.

[15] Perlette J，Tan W H.Real-time monitoring of intracellular mRNA hybridization inside single living cells[J].Anal Chem，2001，73(22)：5544-5550.

[16] Koshkin A A,Nielsen P,Meldgaard M，et al.LNA(Locked nucleic acid):An RNA mimic forming exceedingly stable LNA：LNA duplexes[J].J Am Chem Soc，1998，120(50)：13252-13253.

[17] Yang Chaoyong James，Lin Hui，Tan Weihong.Molecular assembly of superquenchers in signaling molecular interactions[J].J Am Chem Soc，2005，127(37)：12772-12773.

[18] Grossmann T N，R?glin L,Seitz O.Triplex molecular beacons as modular probes for DNA detection[J].Angew Chem Int Ed，2007，46(27)：5223-5225.