宋偉峰馬斌李瑞明

正交試驗(yàn)法優(yōu)選銀杏葉提取條件※

宋偉峰1馬斌2李瑞明2

目的采用正交試驗(yàn)法優(yōu)選銀杏葉破碎提取的最佳條件。方法考察溶劑用量、乙醇濃度和提取時(shí)間3個(gè)因素，每個(gè)因素選取3個(gè)水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果與結(jié)論最佳工藝為A3B3C3，即用10倍量70%乙醇破碎提取2次，時(shí)間為3min，優(yōu)選得到的工藝穩(wěn)定可行。

銀杏葉；正交試驗(yàn)；破碎提取

銀杏葉又名白果葉、公孫樹葉等，為最古老的中生代孑遺植物銀杏Ginkgo biloba L的干燥葉。由于發(fā)現(xiàn)其所含的主要成分黃酮苷（Ginkgo flavone glycosides）能有效地清除體內(nèi)有毒過氧自由基的作用、銀杏內(nèi)酯（Ginkgolides）具有高度的專屬性抗血小板活化因子（PFA）的作用[1]而引起醫(yī)藥界的關(guān)注，德國Schwabe公司開發(fā)的銀杏葉制劑Tebonin已成為名牌暢銷藥[2]。破碎提取為袁珂等在分析各種傳統(tǒng)溶劑提取法優(yōu)缺點(diǎn)的基礎(chǔ)上，提出并建立了一種新的提取方法。本文采用正交試驗(yàn)對(duì)銀杏葉的破碎提取進(jìn)行了研究，優(yōu)選出最佳工藝條件。

1 儀器及試劑

1.1儀器自動(dòng)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（帶CA-111A冷卻水循環(huán)裝置）（日本EYELA NE-SERIES），SHZ-95多用循環(huán)水式真空泵(鄭州市鞏縣英峪予華儀器廠)，超級(jí)恒溫水?。ㄉ虾Ｊ袑?shí)驗(yàn)儀器廠），日立牌VA-W15Y型破碎混合器，托盤式扭力天平（上海第二天平儀器廠生產(chǎn)），101-1型恒溫鼓風(fēng)烘箱（上海市實(shí)驗(yàn)儀器廠），美國Waters公司2695型高效液相色譜儀。

1.2試劑槲皮素對(duì)照品（供含量測定用，批號(hào)10081-201006），山奈素對(duì)照品（供含量測定用，批號(hào)110861-201003），異鼠李素對(duì)照品（供含量測定用，批號(hào)110860-201005），以上對(duì)照品均有中國藥品生物制品檢驗(yàn)所提供。甲醇為色譜純，水為重蒸餾水，其它試劑均為分析純。藥用酒精；銀杏葉購買自邳州銀杏葉制品有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1銀杏總黃酮苷含量測定的方法銀杏總黃酮苷含量測定的色譜條件與系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)、對(duì)照品溶液的制備、銀杏葉供試品溶液的制備、測定方法均按照中國藥典銀杏葉項(xiàng)下黃酮苷的含量項(xiàng)目規(guī)定進(jìn)行[4]。實(shí)驗(yàn)中提取液中總黃酮的測定為，移取適當(dāng)體積的樣品加入圓底燒瓶中，加入甲醇-25%鹽酸溶液（4:1）混合溶液 25mL，置水浴上加熱回流60min，迅速冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至50mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45m）濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2正交設(shè)計(jì)選取銀杏葉總黃酮提取率為考察指標(biāo)，選用(34)正交方案，考查了溶劑用量、提取次數(shù)和提取時(shí)間3個(gè)因素，每個(gè)因素3個(gè)水平設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，以確定破碎提取法的最佳提取條件，見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)水平

2.3正交表的選用及結(jié)果按因素水平表所列的各因素水平，選用(34)正交方案進(jìn)行試驗(yàn)。操作方法：每次取銀杏葉 20g，按正交表所列順序進(jìn)行破碎提取，合并提取液，測定總體積和總黃酮的含量，計(jì)算出提取率。具體設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。對(duì)表2進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

由表2直觀分析數(shù)據(jù)顯示，各因素的影響大小順序?yàn)锽乙醇濃度＞A溶劑用量＞C提取時(shí)間。由同一因素的三個(gè)水平比較得知：A3＞A2＞Al、B3＞B1＞B2、C3＞C1＞C2、最佳工藝條件為A3B3C3。方差分析表明，因素B提取乙醇濃度和因素A溶劑用量對(duì)指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率有顯著性差異F比＞F臨界值，C提取時(shí)間比不具有明顯的顯著性。正交給出的最佳工藝條件為A3B3C3，即加10倍量的70%乙醇，提取2次，每次3min。按最佳方案進(jìn)行對(duì)比驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

2.4驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)稱量粉碎好的銀杏葉20g，共3份，分別按照最佳條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，收集乙醇溶液，測定體積及銀杏總黃酮含量，計(jì)算總黃酮的提取率。結(jié)果3次實(shí)驗(yàn)的提取率為96.03%，RSD為6.7%。該方法轉(zhuǎn)移率高，工藝穩(wěn)定，可作為破碎提取銀杏總黃酮的最佳工藝。

3 討論

銀杏葉黃酮苷類成分對(duì)熱和光都比較敏感，在強(qiáng)光照射及長時(shí)間加熱的情況下都容易氧化失去活性。因此，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提取次數(shù)為2次，每次為3min。即可提高提取的效率又可降低了長時(shí)間，高濃度下氧化破壞，提高了水溶性黃酮苷的提取效果率。破碎提取的主要原理是在適當(dāng)溶劑存在下，利用高速旋轉(zhuǎn)的特殊刀具將藥材充分剪斷至微米程度，使細(xì)胞組織中的成分快速轉(zhuǎn)移至溶劑中，通過過濾即可。因此，不但可以避免加熱，而且提取效率大為提高，一次提取l～2min即可完成，為進(jìn)行中草藥中不耐熱成分的提取及提高提取效率展示了新的途徑[5]。

[1]Braquet P.Drugs Fut1987,12(7):63.

[2]鐘雪廬,樂嘉賡.我國開發(fā)銀杏葉制劑現(xiàn)狀與前景[J].中國藥房,1994,5(5).

[3]袁珂,村延釋,翼眷茹.中草藥化學(xué)成分研究中幾種不同提取方法的比較研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),1997,9(4):57.

[4]中華人民共和國藥典委員會(huì).中國藥典,I部[S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2010.

[5]劉延澤,袁珂,冀春茹.中草藥化學(xué)成分提取的新方法:—植物組織破碎提取法(EMS)[J].河南科學(xué),1993,11(4):265-268.

Optimum Extraction of Ginkgo biloba by Orthogonal Test

Song Weifeng Ma Yanbin Li Ruiming

ObjectiveTo study the new extract process of Ginkgo biloba.MethodsUsing the orthogonal design,we observed the effect of solvent,solvent dosage,and extractive time on the content of total flavonoid.Results and conclusionThe best extraction condition was A3 B3 C3,that is,the amount of 70%ethyl alcohol added to 10 times,smashed for 2 times,and extracted 3mins.The extraction process was stable and usable.

Ginkgo biloba; Smashing extraction method; Orthogonal Design

1中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院藥學(xué)部，廣東廣州 510630

2中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，廣東廣州 510080

廣東省重大科技專項(xiàng)項(xiàng)目（2011A080300004）

宋偉峰（1972.4-），男，本科，主管藥師，研究方向：醫(yī)院藥學(xué)，Tel:020-85252500,E-mail:swflsy@163.com.

李瑞明（1974，07-），男，本科，主管藥師。E-mail:liruiming321@163.com.