何秋毅宋偉峰馬斌李瑞明陳 孝

高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析黃芩水煎液的有效成分※

何秋毅1宋偉峰2馬斌1李瑞明1陳 孝1

目的采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）聯(lián)用技術(shù)，對(duì)黃芩水煎液中的有效成分進(jìn)行初步分析。方法采用 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱，以乙腈和水（含體積比 0.5%甲酸）為流動(dòng)相，采用梯度洗脫，流速為0.4mL/min，ESI-MS采用負(fù)離子模式。通過(guò)HPLC-MS/MS在線測(cè)定化合物的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜信息，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)黃芩水煎液的有效成分進(jìn)行分析鑒別。結(jié)果結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道和質(zhì)譜數(shù)據(jù)，21個(gè)成分通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定，4個(gè)通過(guò)對(duì)照品得到了確證。結(jié)論高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法是鑒定黃芩藥材化學(xué)成分的有效方法。

黃芩；水煎液；化學(xué)成分；高液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜

黃芩（Radix Scutellariae）為唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根[1]。黃芩是中國(guó)藥典收載品種，產(chǎn)于河北、遼寧、陜西、山東、內(nèi)蒙古、黑龍江等地，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎，用于濕溫、暑濕，胸悶嘔惡，濕熱痞滿，瀉痢，黃疸，肺熱咳嗽，高熱煩渴，胎動(dòng)不安等[2]?，F(xiàn)代研究證明，黃芩主要含黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、漢黃芩苷、黃芩新素、β-谷甾醇等成分[3-5]。它的抗菌譜較廣，對(duì)多種細(xì)菌、皮膚真菌、鉤端螺旋體等都有抑制作用；另外，還具有抗炎和抑制流感病毒、乙型肝炎病毒的作用[6-8]。

隨著分析科學(xué)的不斷發(fā)展，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)已廣泛用于中藥及生物樣品的分離分析。串聯(lián)質(zhì)譜具有分析速度快、靈敏度高、能給出分子結(jié)構(gòu)信息等優(yōu)點(diǎn)，采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS），可以獲取各化合物的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜信息，從而迅速對(duì)中藥化學(xué)成分進(jìn)行快速分析鑒別。另外，由于中藥飲片主要采用水煎煮的方式服用，研究其水提取液的化學(xué)成分具有重要的意義。本文采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）分析黃芩水煎液中的有效成分，為黃芩的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)理研究奠定了基礎(chǔ)。

圖1 黃芩水提取液的總離子流圖

表1 黃芩水提取液的HPLC-MS分析結(jié)果

1 儀器與試劑

Agilent1100高效液相色譜儀（配有DAD檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器、四元泵），6410B QqQ-MS電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)Agilent公司)，配有MassHunter數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；色譜柱：ZORBAX SB-C18高效液相色譜柱（100mm×2.1mm，3.5μm，美國(guó) Agilent公司）。色譜流動(dòng)相甲醇、乙腈為色譜純（德國(guó)Merck公司），甲酸為分析純（廣州化學(xué)試劑廠），實(shí)驗(yàn)用水為 Milli-Q超純水。黃芩藥材購(gòu)自廣州采芝林藥店，經(jīng)鑒定為唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1樣品提取取黃芩藥材適量粉碎，準(zhǔn)確稱(chēng)取10g置圓底燒瓶中，加100mL水，回流提取2h，提取液冷卻后轉(zhuǎn)移至 100mL的容量瓶中，定容后過(guò)0.45μm濾膜，作為供試品溶液。

2.2色譜及質(zhì)譜條件色譜條件：ZORBAX SBC18高效液相色譜柱（100mm×2.1mm、3.5μm）；流動(dòng)相A為0.5%的甲酸溶液，流動(dòng)相B為乙腈，梯度洗脫程序如下：0～2min，0%B；2～5min，0%～12%B；5～25min，12%～30%B；25～35min，30%～60%B；35～45min，60%～95% B；45.1min，0%B保持10min。流速0.4mL/min；進(jìn)樣量：5.0μL，柱溫：25℃。

質(zhì)譜條件為電噴霧離子源，負(fù)離子掃描模式；噴霧氣壓力：40psi；干燥氣（N2）流速：10.0L/min，干燥氣溫度：350℃；毛細(xì)管電壓：4000V，碎裂電壓：100V，錐孔電壓：60V，碰撞能量0～20V，質(zhì)量數(shù)掃描范圍為50～1500m/z。

2.3成分分析圖1為黃芩藥材水提取液的HPLCMS分析總離子流色譜圖，色譜圖上有30個(gè)明顯的色譜峰，通過(guò)與相關(guān)文獻(xiàn)[9-10]比較每個(gè)色譜峰一級(jí)質(zhì)譜信息、二級(jí)質(zhì)譜信息以及C18色譜柱的洗脫順序，其中的21個(gè)化合物得到了推測(cè)鑒定，這些化合物的保留時(shí)間、一級(jí)質(zhì)譜、多級(jí)質(zhì)譜和分子式詳細(xì)信息見(jiàn)表1，詳細(xì)色譜圖信息見(jiàn)圖1。其中10、20、23、27號(hào)色譜峰分別是黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素，這四個(gè)色譜峰通過(guò)與對(duì)照品對(duì)照比較保留時(shí)間、一級(jí)質(zhì)譜和多級(jí)質(zhì)譜信息得到了確證。黃芩主要含有黃酮類(lèi)化合物，其中黃酮苷類(lèi)包括碳苷（如白楊素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷）和氧苷類(lèi)化合物（如黃芩苷）。碳苷是一類(lèi)特殊的化合物，其糖基以 C-C鍵直接連在苷元的碳原子上。白楊素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷(2)為碳苷，在二級(jí)質(zhì)譜中，能夠觀察到[M-H-60]-、[M-H-90]-和[M-H-120]-的信號(hào)，與黃酮碳苷質(zhì)譜裂解的特征信號(hào)一致。黃芩苷(10)、漢黃芩苷(20)等氧苷在二級(jí)質(zhì)譜中則明顯失去一份子的葡萄糖醛酸，得到[M-H-176]-的信號(hào)。其它 9個(gè)色譜峰由于缺乏相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道和對(duì)照品，結(jié)構(gòu)有待進(jìn)一步分析鑒定。

3 討論

HPLC-MS/MS是分析黃芩有效成分的強(qiáng)有力工具，通過(guò)采用串聯(lián)質(zhì)譜分析化合物的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜信息，可以大致推測(cè)出化合物的結(jié)構(gòu)和類(lèi)型，從而在沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)品的條件下，也能對(duì)黃芩中的有效成分進(jìn)行定性。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)黃芩水煎液進(jìn)行了HPLC-MS/MS分析，研究了其水溶性的化學(xué)成分，通過(guò)HPLC分離共得到了30個(gè)化合物，其中鑒定了21個(gè)化合物。黃芩主要含有黃酮類(lèi)成分，本研究能快速的分析鑒定黃芩中的黃酮類(lèi)成分，同時(shí)還能根據(jù)質(zhì)譜的特征離子，鑒定黃芩中特殊的碳苷化合物。本方法具有快速、靈敏度高的特點(diǎn)，可以作為黃芩藥材鑒定的有效方法。

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Identification of the Major Components From the water Extract of Radix Scutellariae by High-performance Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

He Qiuyi Song Weifeng Ma Yanbin Li Ruiming Chen Xiao

ObjectiveTo identify the active components in Radix Scutellariae by high performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS).MethodsThe separation was performed on an Agilent ZORBAX SB-C18 column with gradient elution of acetonitrile and water (containing 0.5% formic acid)as mobile phase,the flow rate was 0.4 mL/min.On-line ESI-MS/MS in negative mode was used to obtain the MS1 and MS2 data of the analytes.ResultsAccording to the literature and high-resolution data,21 compounds were identified by HPLC-MS/MS and 4 of them were confirmed by a comparison of their tR,MS data with those of the reference substances.ConclusionHPLC-MS/MS is demonstrated as a powerful tool for the rapid identification of the chemical constituents in Radix Scutellariae.

Radix Scutellariae; Water extract; Components; High-performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry

1 中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，廣東廣州 510080

2 中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院藥學(xué)部，廣東廣州 510630

廣東省重大科技專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目（2011A080300004）；廣東省中醫(yī)藥局科研項(xiàng)目（20121145）

何秋毅（1981.9-），男，本科，藥師，主要研究方向?yàn)榕R床藥學(xué)。

李瑞明（1974.7-），男，本科，主管藥師，主要研究方向?yàn)獒t(yī)院制劑。E-mail：liruiming321@163.com.