張少斌，王 粲，劉 慧，劉 曦

(沈陽農業(yè)大學生物科學技術學院，遼寧 沈陽 110866)

肌動蛋白(Actin)是真核生物中普遍存在的一種古老的蛋白質，是構成細胞骨架的主要成分，也是維持細胞形態(tài)結構及生長發(fā)育的基礎。Actin最早在動物骨骼肌細胞中被發(fā)現，我國科學家閻隆飛等[1]首次證明了植物Actin的存在。在細胞中肌動蛋白結合蛋白(Actin binding proteins，ABPs)調控下，Actin微絲的長度、極性、穩(wěn)定性和三維結構處于動態(tài)變化之中，并將Actin纖維與細胞漿和細胞膜的其它成分相連接，從而調節(jié)Actin的理化狀態(tài)，藉以完成多種細胞功能，包括細胞分裂[2]、內吞作用[3]、細胞信號傳導[4,5]、重力感應[6,7]、細胞頂端生長[8,9]、細胞器運動[10～12]等。

近年來，人們陸續(xù)從高等動植物體中克隆了Actin基因，并分離純化出許多肌動蛋白異型體。通過對擬南芥Actin基因家族的系統發(fā)育分析，將它們分成營養(yǎng)型肌動蛋白(Vegetative actin)和生殖型肌動蛋白(Reproductive actin)，其表達具有明顯的組織特異性，并且在大多數組織和器官中往往同時大量表達著兩種以上的肌動蛋白異型體[13]，且不同肌動蛋白異型體的表達具有時空的特異性，發(fā)揮作用也不盡相同。

作者在此采用RT-PCR技術克隆了豌豆肌動蛋白異型體PEAc3完整編碼區(qū)的cDNA序列，并作了生物信息學分析，推斷了編碼蛋白的結構，擬為進一步研究其結構與其生物學作用之間的聯系奠定基礎。

1 實驗

1.1 材料及主要試劑

豌豆(Pisumsativum.)卷須采自溫室培養(yǎng)的豌豆植株；大腸桿菌DH5α、質粒pET-30，實驗室保存；克隆載體pGEM-T easy，Promega公司；dNTP、Taq聚合酶、膠回收試劑盒、TRizol，Takara公司；其它試劑均為進口或國產分析純。

引物合成及測序由上海生工生物技術有限公司完成。

1.2 肌動蛋白基因克隆與測序

總RNA提取采用TRizol法，0.1 g卷須加入1 mL TRizol。參照張少斌等[14]的RT-PCR方法，首先將mRNA反轉錄合成cDNA。根據NCBI檢索到的PEAc3序列，設計引物如下：

上游：GC GAATTC ATGGCAGAATCCGA-AGATAT(EcoRI)；下游：GC GGTACC GAAGCATTTCCTGTGTAC(KpnI)。

反應條件為：95 ℃熱變性5 min，94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，共35個循環(huán)，72 ℃下延伸10 min，4 ℃保存。

PCR反應結束后，采用瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結果。參照DNA膠回收純化試劑盒說明，將PCR擴增產物的特異性片段進行膠回收，與pGEM-T easy載體連接，轉化，經藍白斑篩選，隨機挑取白斑進行PCR和酶切鑒定，鑒定正確的菌株送上海生工生物技術有限公司測序。

1.3 肌動蛋白生物信息學分析

應用DNAMAN 6.0生物學軟件查找測序得到的核苷酸序列的開放讀碼框，將PEAc3基因的核酸序列翻譯成氨基酸序列，并進行多序列比對，應用生物信息學軟件對氨基酸序列進行結構與功能分析。

2 結果與討論

2.1 PEAc3的克隆與鑒定

RT-PCR產物的質量是關系到最后能否得到正確序列的關鍵因素，從豌豆總RNA中通過RT-PCR擴增PEAc3的序列結果見圖1A。

A.RT-PCR擴增PEAc3 B.重組載體的PCR鑒定 C.重組載體的雙酶切鑒定

由圖1A可知，條帶清晰，大小在1000 bp左右，與核酸序列數據庫登記的大小一致。將擴增產物膠回收后連接到pGEM-T easy克隆載體，構建重組載體pGEM-T-PEAc3，經PCR鑒定(圖1B)和酶切鑒定(圖1C)正確后，送到上海生工生物技術有限公司測序。

2.2 PEAc3序列同源性分析

經序列測定，應用DNAMAN軟件分析核酸序列測序結果，證實為具備完整開放閱讀框的肌動蛋白基因，并推測了其氨基酸序列，與Genbank中注冊的PEAc3序列相比，只有2個氨基酸的差異，分別是328位的S變?yōu)镮、349位的A變?yōu)镾，具體序列如圖2所示。

圖2 克隆的PEAc3氨基酸序列

肌動蛋白基因家族是一個多基因家族，一般具有多個拷貝，碗豆肌動蛋白基因家族進化關系比較見圖3。

圖3 豌豆肌動蛋白基因家族進化關系比較

由圖3可知，通過RT-PCR克隆出的PEAc3基因(圖3中標注為PEAc3 RT-PCR)與Genbank中注冊豌豆肌動蛋白家族基因序列比對發(fā)現，與PEAc9、PEAc12及PEAc3基因注冊序列的親緣關系較近，這與它們同屬于同一類基因家族PEAcⅡ相一致，其中與注冊的PEAc3同源性最高，為99%。而因PEAc3基因與PEAc1、PEAc17、PEAc14屬于不同的豌豆肌動蛋白異型體類別，相應的進化關系較遠。

將PEAc3與在NCBI文庫中檢索到的100多種植物Actin基因進行序列比對，同源性高達89.07%，而且在位點339和350處都是高度保守的，僅同屬豌豆PEAcⅡ類肌動蛋白基因家族的6條注冊序列PEAc3(AAB18641和AAB38511)、PEAc9(AAB18642和AAB38512)和PEAc11(AAB18643和AAB38513)在該位點存在差異。

在檢索到的Actin氨基酸序列中隨機選擇8條(包括PEAc3在內，還有綠豆、擬南芥、大麥、大豆、煙草、獼猴桃和三葉草)比較同源性，結果見表1。

表1 PEAc3與其它7種植物Actin基因的氨基酸序列同源性的比較/%

由表1可看出，PEAc3基因與綠豆的肌動蛋白基因親緣關系較近，這與系統分類學中豌豆與綠豆同屬于豆科相一致，但是與大豆親緣關系則相對較遠。其次是與禾本科的大麥親緣關系相對較近，肌動蛋白在真核生物種內與種間基因存在著不同程度的變異，而且存在大量的肌動蛋白異型體，這使得在分子水平上研究植物界的肌動蛋白基因的進化規(guī)律較為困難。

2.3 PEAc3序列指紋圖譜分析(圖4)

圖4 PEAc3序列指紋圖譜分析

應用DNAMAN6.0推測長度為1134 bp的PEAc3核酸序列，得到了長度為377的氨基酸序列。經疏水性、SignalP 3.0、ProtParam和ScanProfile程序分析推斷，PEAc3分子量為41 668.7 Da，理論等電點為5.31，帶正電的氨基酸殘基(Arg+Lys)數為38個，帶負電的氨基酸殘基(Asp+Glu)數為50個。PEAc3是由3組序列指紋圖譜(Signature)組成的一組序列模體，沒有信號肽部分，以成熟蛋白形式存在，經SOSUI程序分析推測該肌動蛋白為可溶性蛋白。

2.4 PEAc3疏水性分析

疏水性分析結果顯示，疏水性最高比值為2.300，親水性最高比值為2.200(比值浮動范圍為4，數值越高表示該特性越強)，應用TMHMM 2.0程序對蛋白內部跨膜區(qū)的預測與疏水性結果基本相符。預測蛋白可能的跨膜區(qū)有3個或2個，位于氨基酸序列位點137～157、304～322和348～366(N端開始)，但是第二個區(qū)域304～322位點間的疏水性不是很強，程序預測也可能是2個跨膜區(qū)，位于氨基酸序列位點141～157和348～366。

2.5 討論

除了ACTINS_1上結合一些小分子，ACTINS_2高度保守的色氨酸也與N端谷氨酸共同作用結合Ca2+、天冬氨酸結合Sr2+，這些結合能力為PEAc3在體內發(fā)揮細胞信號轉導功能奠定了決定性的基礎。同時色氨酸也是熒光素RHO通過范德華力結合的位點，所以推測這也可能是鬼筆環(huán)肽法活體標記微絲后不能解聚及無法標記單體肌動蛋白的原因。Ca2+存在下微絲解聚成單體肌動蛋白，熒光素與Ca2+共同競爭色氨酸位點，若熒光素競爭力強，則Ca2+無法再結合，微絲不能解聚；而當Ca2+存在下，ACTIN以單體形式存在，鬼筆環(huán)肽標記物也無法再結合。

ACTINS_ACT_LIKE序列中沒有發(fā)現任何配體的結合位點，它折疊纏繞在三維結構的內部，作為保守的序列指紋圖譜很可能起到不可取代的結構支撐作用。有趣的是這段序列是Actin和肌動蛋白結合蛋白共有的序列指紋圖譜，其意義目前還無法解釋清楚。

PEAc3屬于豌豆肌動蛋白家族的Ⅱ類異型體，主要在幼嫩組織中表達。以上只是在Actin結構基礎上的功能預測，在具體的時空中如何表達，真正發(fā)揮哪些作用還需要對該蛋白及其結合蛋白進一步深入研究。

3 結論

根據NCBI文庫中檢索到的序列，采用RT-PCR技術克隆了豌豆肌動蛋白異型體PEAc3完整編碼區(qū)的cDNA序列，基因全長1134 bp，開放閱讀框編碼377個氨基酸。氨基酸序列分析表明，該基因的編碼蛋白PEAc3為可溶性蛋白，分子量41 668.7 Da，沒有信號肽部分，呈酸性，PEAc3包括ACTINS_1(編號：PS00406)、ACTINS_ACT_LIKE(編號：PS01132)以及ACTINS_2(編號：PS00432)3組肌動蛋白序列指紋圖譜(Signature)。序列同源性分析表明PEAc3與其它上百種植物肌動蛋白同源性高達89.07%。

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