廖青玲，王俊杰，李武全，艾杰妮，王錦玲

(1.解放軍總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科三病區(qū)，北京100853;2.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院全軍燒傷研究所，上海200433;3.昆明醫(yī)學(xué)院 第二附屬醫(yī)院云南省燒傷研究所，云南昆明650101)

依達(dá)拉奉對氧剝奪引起的大鼠腸隱窩上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)效應(yīng)研究

廖青玲1，王俊杰2，李武全3，艾杰妮1，王錦玲1

(1.解放軍總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科三病區(qū)，北京100853;2.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院全軍燒傷研究所，上海200433;3.昆明醫(yī)學(xué)院 第二附屬醫(yī)院云南省燒傷研究所，云南昆明650101)

［目的］研究依達(dá)拉奉對氧剝奪導(dǎo)致的IEC-6細(xì)胞株損傷的保護(hù)效應(yīng)。［方法］將預(yù)先培養(yǎng)好的細(xì)胞分為3組:正常組(N組)，氧剝奪組(OGD，IR組)和依達(dá)拉奉治療組(OGD+依達(dá)拉奉，E組)。本研究中所用氧剝奪模型是將細(xì)胞株換無糖無血清的培養(yǎng)基后放入含5%CO2和95%N2的密閉培養(yǎng)箱中2 h，后重新復(fù)氧復(fù)糖。在復(fù)氧復(fù)糖的同時(shí)，將依達(dá)拉奉鹽溶液(10 mg/mL)加入細(xì)胞培養(yǎng)基中。在復(fù)氧復(fù)糖2 h，收集細(xì)胞用DHE熒光探針進(jìn)行氧自由基(ROS)測定;傷后12 h，富集細(xì)胞用于超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的測定;傷后24 h收集細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡和Alamar Blue測定細(xì)胞活力。［結(jié)果］DHE熒光探針結(jié)果顯示OGD導(dǎo)致的ROS，E組比IR組減少;OGD刺激后，IEC-6細(xì)胞內(nèi)的MDA濃度上升為(1.52±0.21)mmol/mg，而E組的含量為(1.21±0.16)mmol/mg，P＜0.05。OGD后，IEC-6細(xì)胞內(nèi)的SOD活力下降至(7.35±0.84)U/mg，而E組的SOD活力為(8.25± 1.12)U/mg，P＜0.05。OGD后細(xì)胞活力下降為0.48±0.081，而E組的細(xì)胞活力為0.56±0.049，P＜0.01。同時(shí)，流式細(xì)胞儀的結(jié)果顯示，依達(dá)拉奉抑制了OGD導(dǎo)致的細(xì)胞過度凋亡。［結(jié)論］依達(dá)拉奉可以減輕OGD造成的IEC-6細(xì)胞的損傷。

依達(dá)拉奉;氧剝奪;腸隱窩上皮細(xì)胞;凋亡

機(jī)體組織器官正常代謝、功能的維持，有賴于良好的血液循環(huán)。各種原因造成的局部組織器官的缺血，常常使組織細(xì)胞發(fā)生缺血性損傷，恢復(fù)血液再灌注后，細(xì)胞功能代謝障礙及結(jié)構(gòu)破壞不但未減輕反而加重，因而將這種血液再灌注后缺血性損傷進(jìn)一步加重的現(xiàn)象稱為缺血再灌注損傷(ischemiareperfusion injury)［1-2］。燒、創(chuàng)傷患者常因失血發(fā)生缺血再灌注損傷。腦部、心臟、腎臟和胃腸都是較易受到缺血再灌注損傷的器官。腸上皮細(xì)胞在腸黏膜損傷修復(fù)中起著重要的作用。大鼠腸上皮細(xì)胞株(IEC-6)具有正常的未分化的腸上皮隱窩細(xì)胞的特征，因而廣泛用于腸上皮細(xì)胞損傷的相關(guān)研究［3］。依達(dá)拉奉是一種新型的抗氧化劑，目前發(fā)現(xiàn)它對多種器官缺血再灌注損傷都有良好的治療效果。本研究用體外氧糖剝奪(oxygen glucose deprivation，OGD)建立IEC-6細(xì)胞缺血缺氧損傷模型，模擬體內(nèi)腸缺血過程，進(jìn)而研究依達(dá)拉奉對其損傷的保護(hù)效應(yīng)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株及試劑

IEC-6細(xì)胞株購自美國 ATCC細(xì)胞庫，用含10%的胎牛血清(美國Invitrogen)DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Invitrogen)，24 h換液1次。

依達(dá)拉奉購自美國Sigma公司，用DMSO(美國Sigma)溶解至5 mg/mL。活性氧熒光探針購自北京威格拉斯生物技術(shù)有限公司。細(xì)胞凋亡試劑盒購自南京碧云天生物技術(shù)研究所。細(xì)胞活力測定試劑盒購自美國Invitrogen公司。超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)購自南京建成生物工程研究所。

1.2 體外氧糖剝奪(OGD)模型建立

將IEC-6細(xì)胞預(yù)先鋪被在12和96孔板，先將細(xì)胞采用無糖無血清培養(yǎng)液，置于含CO2∶N2(5∶95)的37℃恒溫密閉容器內(nèi)120 min，后換為含10%血清的正常培養(yǎng)液，放至正常CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，模擬體內(nèi)缺血再灌注過程［1］。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

將預(yù)先培養(yǎng)好的細(xì)胞分為3組:正常組(無OGD，N組)，氧剝奪組(OGD，IR組)和依達(dá)拉奉治療組(OGD+依達(dá)拉奉，E組)。在E組，依達(dá)拉奉(10 mg/mL)在 OGD后立即加入細(xì)胞培養(yǎng)基中。OGD后2 h收集細(xì)胞用于活性氧(ROS)測定，傷后12 h，富集細(xì)胞用于超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的測定，傷后24 h收集細(xì)胞用于細(xì)胞凋亡和細(xì)胞活力檢測。

1.4 ROS測定

ROS熒光探針-二氫乙啶(Dihydroethidium，DHE)，可自由透過活細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并被細(xì)胞內(nèi)的ROS氧化，形成氧化乙啶;氧化乙啶可摻入染色體DNA中，產(chǎn)生紅色熒光。根據(jù)活細(xì)胞中紅色熒光的產(chǎn)生，可以判斷細(xì)胞ROS含量的多少和變化。本實(shí)驗(yàn)將DHE加入到鋪被好12孔板中，使DHE的終濃度為10 μmol/L，37℃避光孵育20 min，然后用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，后用Leica DMI 3000熒光顯微鏡觀測紅色熒光的亮度。

1.5 細(xì)胞內(nèi)SOD和MDA的測定

IEC-6細(xì)胞收集后，超聲裂解，離心取上清液后，按照商用試劑盒的使用說明書進(jìn)行 SOD和MDA的檢測。

1.6 細(xì)胞凋亡測定

凋亡試劑盒中含有Annexin-V(AV)和碘化丙啶(PI)染色液，按照試劑盒說明書染色后，用流式細(xì)胞儀檢測。正常的IEC-6活細(xì)胞不被AV和PI染色;凋亡早期的IEC-6細(xì)胞僅被AV染色;凋亡晚期和壞死的IEC-6細(xì)胞同時(shí)被AV和PI所染色。

1.7 細(xì)胞活力的測定

在預(yù)先鋪被好IEC-6細(xì)胞的96孔板中加入AlamarBlue工作液(1∶10)，混勻后將96孔板放入37℃溫箱里撫育4 h后用Bio-TekExl 800微孔酶標(biāo)測定儀(美國Thermo)在570 nm處測定(630 nm作為參考波長)。細(xì)胞活力值用吸光度(A)值表示，A值跟細(xì)胞的活力成正比。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x ±s)的形式表示，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，將P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 依達(dá)拉奉對OGD后IEC-6細(xì)胞株內(nèi)ROS的影響

本研究中，ROS熒光探針-DHE的紅色熒光強(qiáng)度顯示，IR組IEC-6細(xì)胞內(nèi)有大量的ROS產(chǎn)生，而E組IEC-6細(xì)胞內(nèi)的ROS明顯減少。見圖1。

2.2 依達(dá)拉奉對OGD后IEC-6細(xì)胞株內(nèi)SOD活力和MDA含量的影響

IR組IEC-6細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA的含量增加，而 E組 MDA濃度比 IR組顯著降低(P＜0.05);IR組IEC-6細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶SOD的活力下降，而 E組 SOD的活力比IR組明顯升高(P＜0.05)。見表1。

圖1 依達(dá)拉奉對OGD后IEC-6細(xì)胞株內(nèi)ROS產(chǎn)生的影響Fig 1 Effects of edaravone on OGD-induced ROS production

表1 依達(dá)拉奉對OGD后IEC-6細(xì)胞株內(nèi)SOD活力和MDA含量的影響Tab 1 Effects of edaravone on OGD-induced change in SOD activity and MDA concentration

2.3 依達(dá)拉奉對OGD后IEC-6細(xì)胞凋亡的影響

IR組IEC-6細(xì)胞的凋亡明顯高于N組和E組。見圖2。

2.4 依達(dá)拉奉對OGD后IEC-6細(xì)胞活力的影響

正常狀態(tài)下 IEC-6細(xì)胞的活力值為 0.69± 0.061，OGD細(xì)胞活力降低，但E組的0.56±0.049比IR組的0.48±0.081明顯升高(P＜0.01)。

圖2 依達(dá)拉奉對OGD后IEC-6細(xì)胞凋亡的影響Fig 2 Effects of Edaravone on OGD-induced cell apoptosis at 24 h post-injury

3 討論

腸缺血時(shí)液體通過毛細(xì)血管濾出而形成間質(zhì)水腫。再灌注后，腸道毛細(xì)血管通透性更加升高，嚴(yán)重腸缺血-再灌注損傷的特征為腸黏膜損傷。這可導(dǎo)致腸道的吸收功能障礙及黏膜的通透性升高，腸道內(nèi)大量細(xì)菌和內(nèi)毒素侵入體循環(huán)及組織中，造成腸源性內(nèi)毒素血癥［1-2］。腸上皮細(xì)胞是腸道屏障的重要組成部分，是宿主與病原微生物雙向聯(lián)系的第一道防御。而缺血再灌注損傷過程中，常導(dǎo)致上皮細(xì)胞的凋亡，IEC-6具有正常未分化腸上皮隱窩細(xì)胞的特征，本研究用體外氧糖剝奪(OGD)建立IEC-6細(xì)胞缺血缺氧損傷模型，模擬體內(nèi)腸缺血過程。

依達(dá)拉奉是一種新型的抗氧化劑，目前臨床上主要應(yīng)用于腦中風(fēng)后的患者。它的主要藥理機(jī)制是可以中和·OH和ONOO-等［2-3］。目前研究發(fā)現(xiàn)，依達(dá)拉奉對于腦、肺、心臟、神經(jīng)和腎缺血再灌注損傷都有良好的治療效果［4-7］。本實(shí)驗(yàn)在建立了OGD引起的細(xì)胞損傷模型后，研究依達(dá)拉奉對其的治療效果。

缺血再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制跟自由基大量產(chǎn)生有關(guān)，而自由基產(chǎn)生跟黃嘌呤氧化酶形成增多，中性粒細(xì)胞的呼吸爆發(fā)，線粒體功能受損和兒茶酚胺自身氧化增加有關(guān)［4，7］。自由基對細(xì)胞的損傷作用主要是通過對膜磷脂、蛋白質(zhì)酶類和核酸的破壞作用實(shí)現(xiàn)的。本研究發(fā)現(xiàn)，OGD導(dǎo)致了大量的ROS產(chǎn)生。同時(shí)ROS的大量產(chǎn)生可以導(dǎo)致膜磷脂的損傷進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)MDA的積累。SOD是體內(nèi)的重要抗氧化劑，它可以通過氧化自身來清除體內(nèi)遭受損傷時(shí)過度產(chǎn)生的自由基，OGD過程中導(dǎo)致SOD的大量消耗。本研究發(fā)現(xiàn)，依達(dá)拉奉減輕了ROS的過度產(chǎn)生，細(xì)胞內(nèi)MDA的蓄積和SOD活力下降。

OGD導(dǎo)致大量的自由基的積累不但會導(dǎo)致膜磷脂、蛋白質(zhì)和核酸的破壞過程當(dāng)中，進(jìn)而引起細(xì)胞的凋亡。目前的研究表明細(xì)胞凋亡是缺血再灌注損傷早期細(xì)胞死亡的主要方式［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，OGD導(dǎo)致細(xì)胞過度凋亡和細(xì)胞活力的降低，而外源性的依達(dá)拉奉的攝入可以減輕這樣的損傷。

［1］Sasano N，Enomoto A，Hosoi Y，et al.Free radical scavenger edaravone suppresses x-ray-induced apoptosis through p53 inhibition in MOLT-4 cells［J］.J Radiat Res (Tokyo)，2007，48(6):495-503.

［2］Li Y，Xia AZ，Xing SH.Protective effect of edaravone against renal ischemia/reperfusion injury and compared with ischemic post conditioning in rats［J］.Yao Xue Xue Bao，2010，45(7):840-848.

［3］魏愛宣，李昕華，閏世軍，等.大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)、鑒定及氧糖剝奪模型的建立［J］.中國老年學(xué)雜志，2010，30(3):340-342.

［4］Zhang P，Li W，Li L，et al.Treatment with edaravone attenuates ischemic brain injury and inhibits neurogenesis in the subventricular zone of adult rats after focal cerebral ischemia and reperfusion injury［J］.Neuroscience，2011，201:297-306.

［5］Ishii J，Natsume A，Wakabayashi T，et al.The free-radical scavenger edaravone restores the differentiation of human neural precursor cells after radiation-induced oxidative stress［J］.Neurosci Lett，2007，423(3):225-230.

［6］Iida H，Nagasaka T，Shindo K，et al.Effect of the free radical scavenger edaravone on peripheral nerve ischemiareperfusion injury［J］.Muscle Nerve，2009，40(4):582-588.

［7］Yamazaki K，Miwa S，Toyokuni S，et al.Effect of edaravone，a novel free radical scavenger，supplemented to cardioplegia on myocardial function after cardioplegic arrest: in vitro study of isolated rat heart［J］.Heart Vessels，2009，24(3):228-235.

［8］Cai J，Kang Z，Liu WW，et al.Hydrogen therapy reduces apoptosis in neonatal hypoxia-ischemia rat model［J］.Neurosci Lett，2008，441(7):167-172.

Therapeutic efficacy of Edaravone on oxygen/glucose deprivation induced rat intestinal epithelial cells damage in vitro

LIAO Qing-ling1，WANG Jun-jie2，LI Wu-quan3，AI Jie-ni1，WANG Jin-ling1
(1.Department of Neurology，South Building，General Hospital of PLA，Beijing 100853，China;2.Burn Center，Changhai Hospital，Second Military Medical University，Shanghai 200433，China;3.Burn Center of Yunnan Province，Second Affiliated Hospital of Kunming Medical College，Kunming 650101，China)

［Objective］To investigate the protective effect of Edaravone on oxygen/glucose deprivation(OGD)-induced rat intestinal epithelial cells damage.［Methods］Cells were divided into normal group(with out OGD，group N)，OGD group(OGD，group IR)and Edaravone treatment group(OGD+edaravone treatment，group E).IEC-6 cells，cultured with serum and sugar free medium，were put in closed incubator filled with 5%CO2and 95%N2mixed gas and two hours latter，cells were changed to normal condition.Edaravone(10 mg/mL)were administered just after OGD treatment in group E.At 2 hs in normal condition，the cells were collected for ROS determination with the DHE probe.At 12 hs post injury，the cells were collected for detections of malonaldehyde(MDA)and superoxide dismutase(SOD).At 24 hs post injury，the cells were used for detection apoptosis with the flow cytometry and cell viability measurement with AlamarBlue.［Results］The DHE probe results showed that the ROS caused by OGD was less in goup E than IR.After OGD，MDA levels were increased to(1.52±0.21)mmol/mg and in Edaravone treatment group，the MDA levels were(1.21±0.16)mmol/ mg(P＜0.05).After OGD，SOD activities were decreased to(7.35±0.84)U/mg and in Edaravone treatment group，the SOD activities were(8.25±1.12)U/mg(P＜0.05).After OGD，cell viability was decreased to 0.48±0.081 and in Edaravone treatment group，cell viability was 0.56±0.049(P＜0.01).Furthermore，the results from the flow cytometry showed that edaravone reduced the OGD-induced cell apoptosis.［Conclusion］Edaravone is an effective for OGD-induced IEC-6 cell damage.

Edaravone;oxygen/glucose deprivation;intestinal epithelial cells;apoptosis

R644

A

1671-7295(2012)04-0348-04

2012-01-12;

2012-06-21

廖青玲(1986-)，女，江西吉安人，護(hù)士。E-mail:liaoqingling1986@163.com