趙艷紅，丁文勇，吳軍兵，王春仁

(1.中國食品藥品檢定研究院醫(yī)療器械檢定所生物材料和組織工程室，北京100050;2.國家食品藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術審評中心，北京100044;3.大連醫(yī)科大學生化教研室，遼寧大連116044;4.中國科學院生物物理學研究所，北京100101)

煙草凝聚物對人正常支氣管上皮細胞中ΔNp63α表達的影響

趙艷紅1，2，丁文勇3，吳軍兵4，王春仁1

(1.中國食品藥品檢定研究院醫(yī)療器械檢定所生物材料和組織工程室，北京100050;2.國家食品藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術審評中心，北京100044;3.大連醫(yī)科大學生化教研室，遼寧大連116044;4.中國科學院生物物理學研究所，北京100101)

［目的］探討ΔNp63α與吸煙型肺癌發(fā)生的關系。［方法］用煙草凝聚物處理體外培養(yǎng)正常支氣管上皮細胞HBE，并分別用Realtime PCR和Western blot檢測其ΔNp63αmRNA和蛋白的表達。同時構建ΔNp63α的基因組啟動子載體，利用熒光素酶分析煙草凝聚物對其轉錄活性的影響。［結果］煙草凝聚物處理后，HBE細胞中ΔNp63α mRNA和蛋白的表達明顯增多，且具有劑量依賴性，以50 μg/mL濃度誘導效應最明顯，mRNA和蛋白表達分別升高93%和311%。煙草凝聚物能夠顯著增強ΔNp63α啟動子的轉錄活性，同樣表現(xiàn)出劑量依賴性，50 μg/mL的誘導效應最明顯，轉錄活性升高140%。［結論］煙草凝聚物能夠通過增強ΔNp63α啟動子的轉錄活性而誘導ΔNp63α的表達，說明ΔNp63α可能與吸煙導致的肺癌發(fā)生相關。

煙草凝聚物;肺癌;ΔNp63α

在20世紀50年代，Doll和Hill首次進行了吸煙與肺癌關系的流行病學研究。他們的回顧性研究發(fā)現(xiàn)，吸煙與肺癌的發(fā)生密切相關。吸煙時間越長，初始吸煙年齡越小的人越容易發(fā)生肺癌［1-2］。之后，吸煙與肺癌的研究一直方興未艾，越來越多的研究證實了吸煙人群比非吸煙人群更容易罹患肺癌。

p63α是抑癌基因p53的同源基因，其在細胞分化、增殖、凋亡等多個細胞生命活動中發(fā)揮了重要的作用［3］。p63α包括全長型p63α(TAp63α)和截短型p63α(ΔNp63α)兩個亞型，其中ΔNp63α表達增加與多種惡性腫瘤的發(fā)生相關［4］。已有研究表明，ΔNp63α在小細胞肺癌中處于高表達水平，說明ΔNp63α可能與肺癌的發(fā)生密切相關［5-6］。最新研究發(fā)現(xiàn)，煙草凝聚物處理非小細胞肺癌細胞后能夠以ΔNp63α依賴方式誘導COX-2基因的表達［7］。為了進一步了解ΔNp63α在吸煙導致肺癌過程中的生物學作用，本研究利用煙草凝聚物處理正常人支氣管上皮細胞系HBE，通過檢測ΔNp63α表達來探討ΔNp63α與吸煙型肺癌發(fā)生的關系。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

人正常支氣管上皮細胞HBE為研究室保存。RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Invitrogen公司。Western blot試劑盒購自美國Pierce公司。所有抗體購自美國Santacruze公司。Realtime PCR試劑盒購自Takara公司。雙熒光素酶報告系統(tǒng)購自美國 Promega公司。細胞轉染試劑 Lipofactamine 2000購自美國Invitrogen公司。其它生化試劑購自美國Sigma公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

正常支氣管上皮細胞HBE常規(guī)培養(yǎng)在加有10%FBS、谷氨酰胺和青鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2的孵箱培養(yǎng)。待細胞生長到融合度為80%～90%左右后，利用0.5%胰蛋白酶進行消化，重新接種培養(yǎng)。

1.3 煙草凝聚物

本研究使用的煙草凝聚物提取于13 mg焦油含量的紅金龍牌香煙。具體制備過程如下:將15支香煙通過50 mL注射器與收集瓶相連。香煙點燃后，通過抽吸裝置，將煙霧收集到收集瓶中。待液氮冷凍凝聚后，用10 mL DMSO將煙霧凝聚物溶解，最終將濃度調整為10 mg/mL。最后經過濾膜過濾后保存在-80℃冰箱中。采用不同濃度(0、5、10、25、50、100 μg/mL)的煙草凝聚物處理細胞，24 h后收集細胞進行后續(xù)實驗。

1.4 Realtime PCR

利用Trizol試劑提取細胞總RNA，具體方法參見Invitrogen公司的說明書。采用 Takara公司的SYBR?Premix Ex TaqTMII(Perfect Real Time)試劑盒進行mRNA定量分析。引物序列如下:ΔNp63α (上游引物為5＇-TGTACCTGGAAAACAATGCCC A-3＇，下游引物為5＇-GACGAGGAGCCGTTCTGAATCT -3＇);18SRNA(上游引物為5＇-ACATCCAAGGAAGGC AGCAG-3＇，下游引物為5＇-TCGTCACTACCTCCCCGG-3＇)。18SRNA作為內參基因。PCR體系配制參照Takara公司說明書。目的基因相對表達水平采 用 2-△△CT方 法來 計 算。即 △△CT= (CT實驗組目的基因-CT實驗組內參基因) -(CT對照組目的基因-CT對照組內參基因)，其中CT(Threshold cycle)為閾值循環(huán)數(shù)。為了更清晰表達各組之間表達水平的差異，將對照組的表達水平人為設定為100%。

1.5 Western blot

將待測細胞用PBS洗3次后，用細胞裂解液裂解細胞，冰上孵育30 min后，經過4℃，15000 RPM離心20 min后，收集上清，即細胞總蛋白。將蛋白定量后，取5 μg蛋白進行12%濃度的SDS-聚丙烯凝膠凝膠電泳。利用半干轉印技術將蛋白轉移到PVDF膜上。經過5%脫脂奶粉封閉1 h后，與抗ΔNp63α的羊源第一抗體(sc-8609，Santa Cruz Biotech)室溫孵育2 h。然后與HRP標記的兔抗羊第二抗體孵育1 h，最后利用化學發(fā)光試劑盒(普利萊公司)檢測熒光信號。利用Odyssey近紅外雙色激光成像系統(tǒng)采集信號。

1.6 細胞轉染

轉染前1天，接種細胞，保證轉染時細胞融合度達到90%左右。用無血清培養(yǎng)基分別稀釋轉染試劑Lipofectamine 2000(Invitrogen)和質粒。然后將二者混合，加入到待轉染的細胞中。4 h后，將培養(yǎng)基倒掉，加入新鮮的完全培養(yǎng)基。

1.7 ΔNp63α基因啟動子構建

根據(jù)之前的研究報道［8］，本研究從正常人角化細胞中分離了ΔNp63α基因組片段(-1584到+61)。此片段具有較強的ΔNp63α基因轉錄活性。本研究將此序列克隆到pGL3-basic載體中，此載體是Promega公司專門為檢測基因轉錄活性而設計的。

1.8 啟動子活性分析

采用Promega公司Dual-Luciferase Reporter Assay System雙熒光素酶報告系統(tǒng)進行啟動子轉錄活性分析。具體步驟如下:于 96孔板內用 Lipofectamine 2000瞬時轉染細胞，48 h后，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗3遍，加入PLB細胞裂解液，待細胞充分裂解后，加入LAR II檢測液，充分混合后檢測螢火蟲熒光素酶活性，然后加入Stop＆Glo檢測液檢測海腎熒光素酶活性。然后計算二者的比值，即為熒光素酶的相對活性RLA(relative luciferase activity)。

1.9 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。Realtime PCR和啟動子活性分析實驗均重復3次，據(jù)此計算均數(shù)±標準差，實驗組之間差異的統(tǒng)計學分析采用Student-T檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 煙草凝聚物對ΔNp63α mRNA表達的影響

Realtime PCR結果顯示，煙草凝聚物能夠誘導ΔNp63α mRNA的表達，并具有一定的劑量依賴性。10 μg/mL的煙草凝聚物就能夠引起ΔNp63α mRNA表達水平升高22%。隨著濃度的升高，ΔNp63α mRNA的表達水平也逐漸升高，50 μg/mL的煙草凝聚物的誘導效應最明顯，表達水平升高93%。見圖1。

圖1 煙霧凝聚物對ΔNp63α mRNA表達的影響Fig 1 The impact of cigarette smoke extracts on the expression of ΔNp63α mRNA

2.2 煙草凝聚物對ΔNp63α蛋白表達的影響

煙草凝聚物能夠誘導ΔNp63α蛋白的表達，并且具有一定的劑量依賴性。10 μg/mL的煙草凝聚物就能夠引起ΔNp63α蛋白表達水平升高，半定量分析表明表達水平升高68%。隨著煙草凝聚物濃度的升高，ΔNp63α蛋白的表達水平也逐漸升高，50 μg/mL的煙草凝聚物的誘導效應最明顯，表達水平升高311%。

圖2 煙霧凝聚物對ΔNp63α蛋白表達的影響Fig 2 The impact of cigarette smoke extracts on the expression of ΔNp63α protein

2.3 煙草凝聚物對ΔNp63α基因啟動子轉錄活性的影響

煙草凝聚物能夠增強ΔNp63α啟動子的轉錄活性，具有一定的劑量依賴性。10 μg/mL的煙草凝聚物能夠誘導轉錄活性增加48%。隨著煙草凝聚物濃度的增加，轉錄活性也逐漸增強，50 μg/mL的煙草凝聚物表現(xiàn)出最大的誘導效應，啟動子活性增加了140%。見圖3。

圖3 煙霧凝聚物對ΔNp63α啟動子活性的影響Fig 3 The impact of cigarette smoke extracts on the transcriptional activity of ΔNp63α promoter

3 討論

目前的研究發(fā)現(xiàn)，煙草中含有超過4000種的化學成分，其中有近60種具有致癌風險，并且這些物質的致癌性已經被國際癌癥研究機構確認［9］。這些致癌物被人體吸收后，其代謝產物能夠誘發(fā)癌癥的發(fā)生。煙草中的多種致癌物可以在細胞內誘導形成DNA加合物，后者能夠干擾DNA的復制及轉錄過程［10］。二醇環(huán)氧化物即是一種典型的DNA加合誘導劑，它能夠通過脫嘌呤作用誘導DNA加合物的形成［11］。DNA加合物形成后一般能夠被細胞自有的修復機制所修復。如果修復失敗，可能導致細胞生命活動的紊亂。尤其是當受累的DNA位于重要的癌基因序列內的時候，可能導致癌基因的激活，原癌基因Ras就是一個典型的例子。Ras是20世紀70年代發(fā)現(xiàn)的一個癌基因家族，其在細胞的信號傳遞和細胞增殖過程中發(fā)揮著關鍵作用［12-13］。Ras表達水平升高常見于多種惡性腫瘤中。人體的許多細胞增殖性疾病(如動脈粥樣硬化等)的發(fā)病過程也與Ras表達失調相關。Ras激活主要通過突變來實現(xiàn)，幾個位點的點突變即可以導致Ras的激活。最常見的Ras基因突變位點是第12、13、59或61位氨基酸密碼子［14-15］。近期研究發(fā)現(xiàn)，一種煙草中的致癌物4-甲基亞硝胺基-1-3-吡啶基-1-丁酮(NNK)能夠誘導Ras基因的DNA加合物形成，從而激活Ras，最終導致肺癌發(fā)生［16］。本研究發(fā)現(xiàn)了一個新的與吸煙相關的易感基因，即ΔNp63α。人類p63α基因作為p53家族的一員，具有p53家族成員的典型特征。p63α基因具有3個主要功能區(qū)，分別是影響反式激活的氨基末端區(qū)(TA)、與靶DNA結合的中心區(qū)(DBD)以及隨機寡聚化區(qū)(OD)［3］。此外，其氨基末端還有一個SAM結構域(Sterile alpha motif，SAM)，發(fā)揮類似隨機寡聚區(qū)的作用［17］。p63α包括兩種亞型，即全長型的TAp63α以及截短型的ΔNp63α。ΔNp63α缺乏反式激活區(qū)，能夠以dominant negative的方式調節(jié)抑制 TAp63α和 p53功能［3］。目前的研究報道，ΔNp63α多被認為發(fā)揮原癌基因的功能。本研究的結果也證實了這一觀點。同時，本研究的發(fā)現(xiàn)也提示了ΔNp63α可能是吸煙導致肺癌發(fā)生過程中的一個重要基因。鑒于本研究的體外研究特性，進一步的臨床流行病學與病理學研究將有助于深入認識ΔNp63α與吸煙導致肺癌發(fā)生的相關性。

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Promotion effect of cigarette smoke extracts on human normal bronchial epithelial cells to express ΔNp63α in vitro

ZHAO Yan-hong1，2，DING Wen-yong3，WU Jun-bing4，WANG Chun-ren1
(1.Institute for Medical Devices Control，National Institutes for Food and Drug Control，Beijing 100050，China;2.Center for Medical Device Evaluation/SFDA，Beijing 100044，China;3.Biochemistry Teaching and Research Division，Dalian Medical University，Dalian 116044，China;4.Institute of Biophysics，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100101，China)

［Objective］To study the correlation of ΔNp63α expression with cigarette smoking-induced lung cancer.［Methods］We cultured exposed human normal bronchial epithelial cells(HBE cells)to cigarette smoke extracts and detected the protein and mRNA levels of ΔNp63α with Western blot and realtime PCR respectively.We also cloned the genomic promoter of ΔNp63α and determined its transcriptional activity after exposure to cigarette smoke extracts.［Results］The cigarette smoke extracts induced the expression of ΔNp63α both at protein and mRNA levels significantly in a dose dependent manner.The cigarette smoke extracts at 50 μg/mL induced 93%and 311%increasing of mRNA and protein levels respectively.The transcriptional activity of the ΔNp63α promoter was also enhanced by cigarette smoke extracts in a dose dependent manner.The extracts at 50 μg/mL induced 140%increasing of transcriptional activity.［Conclusion］Cigarette smoke extracts could induce the expression of ΔNp63α by enhancing its transcriptional activity and this finding indicated that ΔNp63α might be involved in cigarette smoking-induced lung cancer.

cigarette smoke extracts;non-small cell lung cancer;ΔNp63α

Q291

A

1671-7295(2012)04-0335-04

2012-05-11;

2012-06-29

趙艷紅(1976-)，女，遼寧阜新人，博士，助研。E-mail:zhaoyanhongbj@yahoo.com.cn

王春仁，正研究員。E-mail:chunrenwang@263.net