摘 要: 溫度逆境脅迫可以誘導(dǎo)熱激蛋白的表達(dá)，而熱激處理能夠減輕果實(shí)冷害。為了探討溫度逆境對香蕉熱激蛋白基因表達(dá)的調(diào)控、辨析香蕉熱激蛋白基因的表達(dá)與果實(shí)冷害的關(guān)系，采用同源序列法分離了香蕉果皮HSP70基因序列-根據(jù)已經(jīng)報道的HSP70基因的氨基酸保守序列設(shè)計引物、以香蕉果皮總 RNA為模板，用RT-PCR方法克隆香蕉的HSP70 cDNA，Northern雜交分析該基因在不同貯藏溫度下的表達(dá)特征。結(jié)果得到2個序列不同的HSP70基因片段，分別命名為Ma-HSP70-1和Ma-HSP70-2，Ma-HSP70-1和Ma-HSP70-2之間的堿基同源性為86.9%，氨基酸同源性為97.1%。Northern雜交的結(jié)果表明，38 ℃短期熱激處理誘導(dǎo)了Ma-HSP70-2基因的表達(dá)，低溫冷藏能使2個基因的表達(dá)增強(qiáng)。并初步認(rèn)為Ma-HSP70可能與香蕉果實(shí)耐冷性有關(guān)。

關(guān)鍵詞： 香蕉； HSP70； cDNA克隆； 序列分析； Northern雜交

中圖分類號：Ｓ６６8．1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：Ａ 文章編號：１００９－９９８０（２０12）０2－0241－０5

Cloning and expression analysis of two fragments of HSP70 cDNA in the peel of banana during storage at high and low temperature

HE Li-hong1，2，CHEN Jian-ye2，WANG Hai-lan2，KUANG Jian-fei2，LU Wang-jin2*

（1College of Life Science，Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangzhou，Guangdong 510225 China； 2Guangdong Key Lab for Postharvest Science，College of Horticulture，South China Agricultural University，Guangzhou，Guangdong 510642 China）

Abstract: Many evidences have indicated that temperature stress can induce heat shock protein expression and heat treatment can alleviate chilling injury of fruits. In the present study， two HSP70 fragments were cloned from banana peel using homology-based method in order to investigate their expressions regulated by temperature stress and the relationship between their expressions and chilling injury. Using PCR degenerate primers designed with reference to the conserved amino acid sequences of known HSP70， total RNA extracted from banana peel was used as templates and HSP70 cDNA fragments were amplified by RT-PCR in order to study their expression characteristics under different environments by Northern hybridization. Two different cDNA fragments， named Ma-HSP70-1 and Ma-HSP70-2， were cloned. The homology between two HSP70 is 86.9% at nucleotide acid sequence level and 97.1% at amino acid sequence level. Using Ma-HSP70-1 and Ma-HSP70-2 as probes， Northern hybridization showed that short-time heat pretreatment（38 ℃）only induced the expression of Ma-HSP70-2 transcripts， However， storage at low temperature enhanced accumulations of 2 HSP70 mRNA. Ma-HSP70 might be related to chilling tolerance of banana fruits．

Key words: Banana； HSP70； cDNA cloning； Sequence； Northern hybridization

生物體在高溫或其他逆境脅迫下形成一組特殊的蛋白—熱激蛋白（heat shock proteins，以下簡稱HSPs），植物HSPs種類很多，根據(jù)分子質(zhì)量大小將HSPs分成：HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和小分子質(zhì)量熱激蛋白smHSP。HSPs具有抗熱性、分子伴侶以及協(xié)助異常蛋白降解等以保護(hù)細(xì)胞免受進(jìn)一步損傷的功能[1-2]。近十幾年來，人們從植物中分離了很多熱激蛋白基因，如在Genebank中登錄了矮牽牛、水稻、筍瓜、綠豆、蕃茄、煙草、小鹽芥、黃瓜、小麥、菠菜、苜蓿、擬南芥、油菜、豌豆、大豆等植物的熱激蛋白基因。香蕉是我國華南地區(qū)的主要水果之一，低溫貯藏能夠延長香蕉果實(shí)的貯藏壽命。但是，香蕉果實(shí)對低溫很敏感，低于 11 ℃就極易發(fā)生冷害。有研究表明，熱處理能夠提高番茄等果實(shí)的耐冷性[3]，我們的研究也表明，38 ℃熱處理也能夠提高香蕉果實(shí)的耐冷性[4]，但熱激蛋白在香蕉果實(shí)耐冷性中的作用怎樣尚缺乏研究。因此，分離、克隆香蕉果實(shí)熱激蛋白基因并分析其表達(dá)特征，對剖析香蕉果實(shí)的熱激蛋白及其基因與果實(shí)耐冷性的關(guān)系及香蕉貯藏技術(shù)改進(jìn)具有重要的理論意義與應(yīng)用價值。越來越多的研究表明在植物中存在交叉適應(yīng)：植物經(jīng)中度脅迫處理不僅能誘導(dǎo)對這種脅迫的抗性，而且能提高對其他脅迫的忍耐力。如，熱預(yù)處理誘導(dǎo)了番茄、杧果、葡萄、鱷梨的抗冷能力[5]；短時間的熱處理（如: 62 ℃，20 s）增強(qiáng)了葡萄柚果皮HSP18-Ⅰ、HSP18-Ⅱ、HSP22和HSP70等基因的表達(dá)，并且這些基因在之后的冷藏過程中持續(xù)表達(dá)，進(jìn)而提高了對低溫的耐性[6]；38 ℃熱處理誘導(dǎo)了葡萄漿果HSP70的表達(dá)，并使果實(shí)獲得了對低溫的耐性[5]。我們應(yīng)用RT-PCR克隆香蕉果實(shí)HSP70基因，Northern雜交方法分析熱處理及低溫冷藏期間該基因的表達(dá)特征，為今后進(jìn)一步全面研究各種分子量的熱激蛋白與香蕉果實(shí)耐冷性的機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試的香蕉品種巴西（Musa AAA group，cv.Brazil）購于廣東省番禺香蕉果園，采收時蕉指飽滿度7～8成，在果園落梳后用箱子裝載即時運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。每梳香蕉分成單個蕉指后，挑選均勻一致的無病、蟲、傷的果實(shí)，經(jīng)500 mg·L-1施保功處理后取出晾干。香蕉果實(shí)用聚乙烯薄膜袋包裝后，置于相應(yīng)恒溫箱（MT-533 incubator， Sanyo， Japan）中貯藏。貯藏條件為：常溫（22 ℃）貯藏，熱處理（38 ℃）及低溫（8 ℃）貯藏，常溫貯藏和熱處理的果實(shí)于貯藏的第1天和第2天分別取樣，由于低溫貯藏需稍長時間才有冷害癥狀，故低溫貯藏的果實(shí)于第3天取樣。每次取10個香蕉果實(shí)，將果皮與果肉分離后用液氮速凍并儲存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA的提取

總RNA的提取及分離方法為熱硼酸法，參照Wan等[7]的方法進(jìn)行。

1.3 引物的設(shè)計與合成

按照GeneBank中登錄的已知HSP70基因氨基酸保守序列，設(shè)計引物。根據(jù)已經(jīng)克隆出來的HSP70 cDNA片段，再在其3’端設(shè)計引物，繼續(xù)向3’端延伸HSP70 cDNA片段。引物見表1。由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4 cDNA克隆與序列分析

以香蕉果皮總RNA作為底物，反轉(zhuǎn)錄合成單鏈cDNA，以該單鏈cDNA為模板與HSP70基因的簡并引物（HSP70 - Up1與HSP70- Dw1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃ 3 min，1個循環(huán)，然后進(jìn)行35個循環(huán)（94 ℃ 1 min，61 ℃ 2 min，72 ℃ 2 min），循環(huán)完畢后，72 ℃再延伸10 min。RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳后，切下目的片段，經(jīng)回收純化后與pMD 18-T （TaKaRa，Shiga，Japan）載體連接， 轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α（TaKaRa，Shiga，Japan）。在LB/ AMP/IPTG/X-Gal平板上篩選陽性克隆，然后隨機(jī)挑選經(jīng)EcoRI/HindⅢ雙酶切（TaKaRa，Shiga，Japan） 確認(rèn)已插入的質(zhì)粒作序列分析。測序工作委托上海英駿生物技術(shù)有限公司完成，采用ABI377（USA）序列分析儀。

1.5 RNA印跡（轉(zhuǎn)膜）

取10 μg RNA，采用含甲醛的1.2 %瓊脂糖凝膠上進(jìn)行變性凝膠電泳（電泳條件：50 V，60 min），電泳結(jié)束后，在2×SSC的溶液中于室溫下浸洗2次，每次20 min。采用上行毛細(xì)管轉(zhuǎn)移方法以20×SSC作為轉(zhuǎn)移緩沖液，將變性RNA從凝膠轉(zhuǎn)移到尼龍膜上 （ Biodyne B 0.45 μm， PALL），轉(zhuǎn)移16～20 h后，將尼龍膜于80 ℃烘烤2 h，再經(jīng)紫外交聯(lián)后存放于4 ℃冰箱備用。

1.6 探針制備

對質(zhì)粒DNA進(jìn)行堿處理，用PCR DIG probe synthesis kit（Roche Applied Science， Mannheim， Germany）合成帶有DIG標(biāo)記的DNA探針，Ma-HSP70-1合成探針的上游引物序列為5’-TGAACCCCATCAACACCGTC-3’，下游引物序列為5’-CCTCA AAGATACCCTCCTCG-3’； Ma-HSP70-2合成探針的上游引物序列為5’-ATGAACCCAACCAACACCGT-3’，下游引物序列為5’-GACCATAGGCAATA GCAGCA-3’。探針合成的具體方法參見說明書（Roche Applied Science， Mannheim， Germany）。

1.7 Northern雜交

將結(jié)合有RNA的尼龍膜在雜交箱中45 ℃預(yù)雜交3 h，預(yù)雜交液包含以下成分：50%去離子甲酰胺、5×SSC、7%SDS、2%阻斷劑、50 mmol·L-1磷酸鈉緩沖液（pH 7.0）和0.1 % 十二烷基肌氨酸鈉 （w/v）。預(yù)雜交完后，倒出預(yù)雜交液，加入DIG標(biāo)記的探針，于45 ℃雜交箱中雜交過夜。雜交完后尼龍膜用2×SSC（含0.1 % SDS）漂洗2次，每次10 min。再用0.1×SSC（含0.1 % SDS）在62 ℃下洗2次，每次30 min，經(jīng)過抗原抗體結(jié)合后的膜用Tween-20洗去未結(jié)合的抗體，然后用CDP-StarTM通過化學(xué)發(fā)光原理檢測雜交信號的強(qiáng)弱。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增

經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增得到1個與目的片段大小相當(dāng)?shù)?10 bp左右的條帶，與pMD 18-T載體連接后，經(jīng)EcoR I/HindⅢ雙酶切確認(rèn)已有片段插入（圖1）。

2.2 序列分析與同源性比較

所測質(zhì)粒中得到2個序列不同的HSP70基因片段。片段長度均為916個堿基，編碼304個氨基酸，分別命名為Ma-HSP70-1和Ma-HSP70-2（序列未列出），為了克隆Ma-HSP70 cDNA全長序列，分別在Ma-HSP70-1和Ma-HSP70-2片斷中設(shè)計特異引物（引物序列見表1的Ma-HSP70-1-Up1和Ma-HSP70-2-Up1），再設(shè)計簡并引物（參見表1的HSP70-Dw2），繼續(xù)向下游擴(kuò)增186個氨基酸，共計擴(kuò)增出1 473個堿基編碼490個氨基酸的Ma-HSP70的序列。這2個片段之間的堿基同源性為86.9%，氨基酸同源性為97.1%（圖2）。

2.3 Ma-HSP70-1、Ma-HSP70-2基因在香蕉果皮常溫、熱激及冷藏貯藏過程中的表達(dá)

38 ℃熱激處理1 d對Ma-HSP70-1基因的表達(dá)影響不大，38 ℃熱激處理2 d表達(dá)信號略微增強(qiáng)；剛采收回來的和在22 ℃常溫貯藏1 d、2 d的香蕉果皮的表達(dá)信號強(qiáng)度相當(dāng)，表明HSP70-1基因是持續(xù)表達(dá)的，即使沒有高溫誘導(dǎo)它也有表達(dá)。8 ℃低溫處理3 d后，Ma-HSP70-2基因的表達(dá)大幅度升高，由此可知Ma-HSP70-2基因的表達(dá)對低溫敏感（圖3）。

38 ℃熱激處理1 d對Ma-HSP70-2基因的表達(dá)影響也不大，38 ℃熱激處理2 d表達(dá)信號增強(qiáng)；剛剛采收回來的和在22 ℃常溫貯藏1 d、2 d的香蕉果皮的表達(dá)信號強(qiáng)度相當(dāng)，表明Ma-HSP70-2基因不經(jīng)逆境脅迫也有表達(dá)，但是比Ma-HSP70-1基因的表達(dá)弱。8 ℃低溫處理3 d后，Ma-HSP70-2基因的表達(dá)大幅度升高，由此可知Ma-HSP70-2基因的表達(dá)受高溫、低溫誘導(dǎo)（圖3）。

3 討 論

1962年Ritossa[8]在果蠅幼蟲發(fā)現(xiàn)熱激反應(yīng)，1974年Tissieres等[9]分離得到70 ku和26 ku的熱激蛋白，之后研究逐漸擴(kuò)展到細(xì)菌、酵母、植物、哺乳動物以及人類等，并發(fā)現(xiàn)熱激蛋白普遍存在于生物體。熱激蛋白不僅由高溫誘導(dǎo)產(chǎn)生，對細(xì)胞產(chǎn)生損傷的各種理化因素也都可以誘導(dǎo)熱激蛋白（如疾病、營養(yǎng)缺乏、紫外線照射、干旱、鹽漬、冷、重金屬和氧化性脅迫）。其中HSP70家族成員廣泛分布于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和葉綠體等細(xì)胞的各個部分，它們具有高度的保守性，真核生物HSP70和大腸桿菌HSP70的同源性大于65%[10]。本試驗(yàn)克隆的香蕉果皮2個HSP70基因片段之間的堿基同源性為86.9%，氨基酸同源性為97.1%，進(jìn)一步證實(shí)了HSP70家族的高度保守性。

生物體內(nèi)的HSPs有些是組成型表達(dá)的，在無刺激的細(xì)胞中也有明顯表達(dá)，或是在細(xì)胞周期的特定階段產(chǎn)生，或是在生物體發(fā)育的某些階段表達(dá)，起著管家基因的作用[11]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)38 ℃短期熱激處理誘導(dǎo)了Ma-HSP70-2基因的表達(dá)，而對Ma-HSP70-1基因表達(dá)的影響不大；Ma-HSP70-1和Ma-HSP70-2基因不經(jīng)溫度脅迫也有表達(dá)，而且Ma-HSP70-1比Ma-HSP70-2基因的表達(dá)強(qiáng)。表明雖然Ma-HSP70-1和Ma-HSP70-2基因都呈現(xiàn)組成型表達(dá)，但短時間高溫卻能誘導(dǎo)Ma-HSP70-2表達(dá)。

研究發(fā)現(xiàn)植物中存在交叉適應(yīng)[5-6]，Collins等[12]認(rèn)為耐冷和HSPs之間有直接關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)8℃冷藏能誘導(dǎo)2個基因的表達(dá)大幅度增強(qiáng)，表明Ma-HSP70-1受低溫誘導(dǎo)；Ma-HSP70-2則可以受低溫和高溫同時誘導(dǎo)。而且Ma-HSP70-2基因低溫誘導(dǎo)比高溫誘導(dǎo)表達(dá)信號要強(qiáng)。

HSP70是主要的分子伴侶，在細(xì)胞內(nèi)分布廣、含量豐富。正常和脅迫條件下，HSP70有防止新合成蛋白質(zhì)聚集和參與新合成蛋白質(zhì)折疊的作用[13]。一些家族成員在有機(jī)體遇到環(huán)境脅迫時才表達(dá)，它們可能參與新合成蛋白質(zhì)的折疊和水解[14]。我們的研究結(jié)果表明38 ℃短期熱激處理誘導(dǎo)了Ma-HSP70-2基因的表達(dá)，8 ℃冷藏誘導(dǎo)了Ma-HSP70-1和Ma-HSP70-2基因的表達(dá)，HSP70的表達(dá)能維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，保護(hù)細(xì)胞免受進(jìn)一步傷害。

4 結(jié) 論

研究根據(jù)GeneBank中登錄的已知HSP70基因氨基酸保守序列，設(shè)計簡并引物。擴(kuò)增HSP70 基因cDNA，得到2個序列不同的HSP70基因片段。2個HSP70基因片段之間的堿基同源性為86.9%，氨基酸同源性為97.1%。利用HSP70 2個基因作為探針進(jìn)行了Northern雜交，結(jié)果表明38 ℃短期熱激處理誘導(dǎo)了Ma-HSP70-2基因的表達(dá)，冷藏能誘導(dǎo)2個基因表達(dá)增強(qiáng)。Ma-HSP70在香蕉溫度逆境脅迫中可能起到一定的作用。

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