摘要: 以健康香蕉植株和感染香蕉枯萎病菌Fusarium oxysporum f. sp. cubense （FOC）后的香蕉植株的根莖葉組織為材料，提取樣品中的總DNA，擴(kuò)增細(xì)菌的16S rDNA的V3可變區(qū)，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DGGE電泳分析，并對其中18條優(yōu)勢條帶進(jìn)行切膠回收、克隆測序和系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果表明，香蕉健株與病株各組織中所含內(nèi)生細(xì)菌的種群豐富度為根部＞假莖＞葉片；感病植株組織內(nèi)生細(xì)菌種類比健康植株豐富；BLAST結(jié)果為大部分克隆序列與已知細(xì)菌16S rDNA基因序列的同源性較高（94%~100%），分別歸屬于藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、放線菌門（Actinobacteria）、變形桿菌門（Proteobacterium）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）和綠菌門（Chlorobi）7大類群；其中一個(gè)序列同源性較低（91%），可能代表新的分類單元。

關(guān)鍵詞: 香蕉；內(nèi)生細(xì)菌；DGGE；群落結(jié)構(gòu)；多樣性

中圖分類號：Ｓ６６8．1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：Ａ 文章編號：１００９－９９８０（２０12）０2－0235－０6

Analysis of entophytic bacteria community structure in banana by PCR-DGGE technique

LIU Fei-fei，LI Chi*，LIU Yong-qin，YU Li

（College of Agriculture， Guangdong Ocean University，Zhanjiang，Guangdong 524088 China）

Abstract: The total genomic DNA was extracted from various tissues of both the healthy bananas and the ones which were infected with Fusarium oxysporum f. sp. cubense （FOC）. Then the 16Sr DNA V3 fragment polymerase chain reaction products amplified from the total genomic DNA were analyzed by denaturing gradient gel electrophoresis （DGGE）. The results of sequence analysis of the 18 DGGE dominant bands showed that the population abundance of endophytic bacteria contained in the healthy banana plants and the infected plants was different. The most abundant population was found in roots ，the middle in the bulb tissue and the least in leaves; The abundance of endophytic bacteria increased after infection with FOC; And most of the sequences were phylogenetically close to Cyanobacteria， Chloroflexi， Actinobacteria， Proteobacterium， Bacteroidetes， Firmicutes and Chlorobi； But the homology for one of the sequences was only 91%. It may represent a new taxon.

Key words： Banana； Entophytic bacteria； Denaturing gradient gel electrophoresis （DGGE）； Community structure； Diversity

植物內(nèi)生細(xì)菌是一類在健康植物棲居，對植物無害并與植物建立和諧關(guān)系，廣泛存在于植物根、莖、葉、花、果實(shí)和種子等器官中的微生物群落[1]。植物內(nèi)生細(xì)菌具有宿主特異性，同一宿主植物的不同器官、生育期及宿主所處的環(huán)境條件的不同，其內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)也不同[2]。目前，內(nèi)生細(xì)菌的研究主要集中在內(nèi)生細(xì)菌的分離鑒定、植物病害的生物防治、對宿主植物的促生作用以及內(nèi)生細(xì)菌種群多樣性研究等領(lǐng)域[3-5]。在研究方法上以傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法為主，但是由于培養(yǎng)條件的限制，可培養(yǎng)細(xì)菌種群數(shù)量僅占細(xì)菌總數(shù)0.1%~10%，90%以上的微生物不能進(jìn)行人工培養(yǎng)[6]。所以，分離培養(yǎng)技術(shù)不能全面、準(zhǔn)確反映微生物種群多樣性概況。PCR-DGGE技術(shù)是近幾年發(fā)展起來的一種技術(shù)，在分析微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的研究中具有檢測極限低，分離快速、簡便、重復(fù)性好和同時(shí)分析多個(gè)樣品的優(yōu)點(diǎn)。目前PCR-DGGE技術(shù)在濕地[7]、污水[8]、海洋[9]等領(lǐng)域微生物多樣性的研究應(yīng)用比較廣泛，在植物內(nèi)生微生物多樣性的研究中也有應(yīng)用[10]。

在香蕉內(nèi)生細(xì)菌多樣性的研究中，國內(nèi)付業(yè)勤等[11]對健康香蕉植株可培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行了研究，明確了可培養(yǎng)細(xì)菌在香蕉植株不同器官中的數(shù)量分布，不動桿菌屬（Acinetobacter）等9種內(nèi)生細(xì)菌對香蕉枯萎病菌有抑制作用。潘羨心用16S rDNA序列分析法證明了香蕉根部具有豐富的內(nèi)生細(xì)菌[12]。我們采用非培養(yǎng)方法，利用PCR-DGGE分子生物學(xué)技術(shù)，研究香蕉內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性，揭示香蕉不同器官健株與病株組織內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異，對了解香蕉和開發(fā)新的微生物資源具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

供試菌種: 2009年從湛江硇洲島采集香蕉枯萎病害標(biāo)本，經(jīng)過分離、鑒定，獲得的純化菌株Fusarium oxysporum f. sp. cubense （FOC），菌株編號HMGDOU40928，保存在廣東海洋大學(xué)植?？萍贾行摹?/p>

供試香蕉苗: 香蕉苗株高30~40 cm，5~6片葉子，品種為巴西蕉。

1.2 主要試劑

DNA marker、DNA Taq 聚合酶、DNA純化試劑盒、pMD18-T載體試劑盒、大腸桿菌DH5感受態(tài)細(xì)胞，購自TAKARA；PCR引物338F-GC、518R、338F、M13-47和M13-48，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 香蕉苗接種及表面消毒

香蕉苗進(jìn)行傷根接種[13]，孢子濃度為106 cfu·mL-1，每個(gè)處理香蕉苗30株，以無菌水為空白對照。各處理的香蕉苗，置室溫常規(guī)盆栽。40 d后的香蕉苗根莖葉各組織進(jìn)行表面消毒處理[14]，同時(shí)將最后一次沖洗水150 μL涂于LB平板上，28 ℃培養(yǎng)72 h，檢測表面滅菌效果，然后用于提取植株組織總DNA。

1.4 組織總DNA提取與純化

參照沈洪等[15]改良的CTAB法提取香蕉根部、假莖、葉片的總DNA?？侱NA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以Hind III DNA Marker做分子質(zhì)量DNA，用Gel Red染色后在紫外凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad GelDoc XR+）中觀察，拍照。

1.5 16S r DNA V3區(qū)PCR的擴(kuò)增

以降落式PCR[16]擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA的V3區(qū)片段。選擇細(xì)菌的16S rDNA的V3區(qū)通用引物338F-GC（5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGG GCGGGG GCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’） 和518R（5’-ATTACCGCGGCTG CTGG-3’），提取得到的總DNA適當(dāng)稀釋后做模板進(jìn)行PCR。PCR體系: 10×PCR buffer 5 μL，dNTP 4 μL（2.5 mmol·L-1），引物各1 μL（10 μmol·L-1），模板DNA 2 μL，Taq酶 0.5 μL（5 U·μL-1），加雙蒸水至50 μL。PCR反應(yīng)條件: 94 ℃變性10 min，94 ℃變性1 min，65 ℃（-1 ℃/循環(huán)）退火1 min，72 ℃延伸2 min，共10個(gè)循環(huán)，然后94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共20個(gè)循環(huán)，最后再72 ℃下延伸10 min。PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測，后用于DGGE分析。

1.6 各組織的DGGE電泳及圖譜分析

DGGE（南京，DGGE-1102）條件為: 聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%，電泳緩沖液為1×TAE，設(shè)置凝膠變性梯度為45%~70%[17]，每孔上樣量為20 μL PCR產(chǎn)物與8 μL 10×加樣緩沖液。電泳溫度為60 ℃，A段電泳電壓60V，45 min，B段電泳電壓120V，10 h。銀染后拍照分析。

所得的DGGE圖譜用Bio-Rad QUANTITY ONE 4.3.0軟件處理，對各個(gè)組織樣品條帶進(jìn)行分析。根據(jù)各個(gè)樣品在DGGE圖譜中的顯示，對其相似性進(jìn)行聚類分析，來比較各樣品中的細(xì)菌落結(jié)構(gòu)和多樣性。

1.7 DGGE條帶克隆測序及系統(tǒng)發(fā)育樹的分析

將優(yōu)勢條帶進(jìn)行切膠回收，4 ℃無菌水中浸泡過夜。以上清液為模板，引物338F（不帶GC夾子）和518R進(jìn)行16S rDNA V3區(qū)的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用純化試劑盒進(jìn)行純化。純化后的產(chǎn)物與pMD18-T載體16 ℃連接3 h，再用熱激法轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌 DH5感受態(tài)細(xì)胞。在含有X-gal、IPTG和氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上，37 ℃過夜培養(yǎng)，篩選出具有氨芐青霉素抗性的白色菌落轉(zhuǎn)化子。利用載體通用引物M13-47（5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’）和M13-48（5’-AGCGG ATAACAA TTTCACACAGGA-3’）進(jìn)行菌落PCR檢測，篩選出陽性菌落后，進(jìn)行搖菌培養(yǎng)，送到上海博尚生物技術(shù)有限公司測序。

序列通過分析比對后去掉載體序列提交到Gen Bank進(jìn)行blast比對。選出同源性最高的序列作為參照菌株，用軟件Clustal X比對后，用MEGA 5軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品總DNA的提取和16Sr DNA V3區(qū)的擴(kuò)增

采用改良后的CTAB方法提取香蕉組織樣品的總DNA，具有較為完整的細(xì)菌基因組DNA。且最后一次淋洗水150 μL涂于LB平板上，28 ℃培養(yǎng)72 h，無菌落生長。選擇細(xì)菌的16S rDNA的V3區(qū)通用引物338F-GC和518R對純化后的各樣品的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得到的DNA片段均為單一條帶（圖1），片段大小約為180 bp，說明擴(kuò)增產(chǎn)物無明顯的非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象。

2.2 DGGE的圖譜及分析

對香蕉植株在感染FOC前后各組織內(nèi)生細(xì)菌的種群多樣性的DGGE圖譜（圖2-I）采用Bio-Rad QUANTITY ONE 4.3.0軟件進(jìn)行分析，結(jié)果見圖2-II。

從DGGE電泳圖譜中可以看出植株各組織中內(nèi)生細(xì)菌種類豐富，且差異性較大。健株的根、莖、葉組織中至少存在22、20和15種不同的內(nèi)生細(xì)菌，病株中至少存在30、27、24種，且感病植株內(nèi)生菌種類明顯比健康植株豐富。1號、2號等條帶較亮，代表健康植株和發(fā)病植株中均存在的優(yōu)勢菌種。5號為病株根部特有條帶，9號、11號、13號為病株假莖特有條帶，17號為病株葉片特有條帶（圖2-I）。

不同組織樣品間條帶的異同，反映了組織之間細(xì)菌群落的相似性和差異性。表1列出了各樣品之間內(nèi)生細(xì)菌相似性結(jié)果: 各樣品間的細(xì)菌群落相似性系數(shù)各不相同；同一植株不同組織相似性系數(shù)差異性顯著，根、莖、葉內(nèi)生細(xì)菌群落相似性系數(shù)都依次降低，健株分別為66.9%、55.0%、43.6%，病株為70.3%、58.0%、46.2%。健株和病株的同類組織的相似性系數(shù)較高，根、莖、葉組織內(nèi)生菌相似性系數(shù)分別為75.5%、78.9%、72.0%。

2.3 優(yōu)勢條帶的系統(tǒng)發(fā)育分析

將DGGE圖譜上比較亮的18個(gè)條帶進(jìn)行回收、克隆、測序，所得序列大小為180 bp左右。通過用BLAST與GenBank數(shù)據(jù)庫序列比對分析，17個(gè)條帶所測序列與數(shù)據(jù)庫中序列相似性在94%~100%（表2），分別歸屬于藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、放線菌門（Actinobacteria）、變形桿菌門（Proteobacterium）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）和綠菌門（Chlorobi） 7大類；另外，4號條帶序列與GenBank登陸號為GQ243083的Proteobacterium關(guān)系最為密切，相似率只有91%，推測香蕉內(nèi)生細(xì)菌群落中可能存在新的種群。

從系統(tǒng)發(fā)育樹可見，7個(gè)序列歸屬于藍(lán)細(xì)菌門Cyanobacterium，占所測序列的38.9%，相似性在98%~100%。7號條帶為擬桿菌門的新鞘氨醇桿菌屬Novosphingobium sp.，是18個(gè)陽性克隆中唯一的可培養(yǎng)細(xì)菌。絕大多數(shù)為不可培養(yǎng)細(xì)菌，占94.4%。由圖2-I分析出，1號和2號比較亮的條帶分別與放線菌屬（Actinomyces sp.）、綠彎菌門（Chloroflexi）同源性較高，2者是健康與發(fā)病的香蕉植株都存在的優(yōu)勢菌群。

3 討 論

在研究植物內(nèi)生細(xì)菌時(shí)，為避免表面其他微生物的污染，減少腐生細(xì)菌DNA殘留問題[15]，應(yīng)對材料進(jìn)行嚴(yán)格的表面消毒，盡量取植物的內(nèi)部組織進(jìn)行總DNA的提取，同時(shí)將最后一次沖洗水進(jìn)行涂平板檢測表面消毒效果，直到培養(yǎng)至無菌落出現(xiàn)為止，這樣才能保證DGGE電泳產(chǎn)生的條帶能反應(yīng)出組織內(nèi)生細(xì)菌種群的多樣性。

內(nèi)生細(xì)菌在香蕉根、假莖、葉片中的菌落豐富度和種群數(shù)量存在差異。各組織中細(xì)菌豐富度為根部>假莖>葉片，呈遞減趨勢，根部內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量最豐富，與羅明等[18]文獻(xiàn)研究結(jié)果一致。這可能與土壤中棲息著豐富的細(xì)菌種類并可以進(jìn)入香蕉根部有關(guān)。從DGGE電泳圖譜中可以看到感病植株組織內(nèi)生菌種類比健康植株豐富，與王愛華等[19]研究結(jié)果一致，可能與植株感病后的自身抵抗力降低，細(xì)菌容易侵入有關(guān)。同一植株根、假莖和葉片內(nèi)生細(xì)菌群落相似性系數(shù)依次降低，推測大部分內(nèi)生細(xì)菌群落是由根向莖再向葉擴(kuò)展分布的，也就是說內(nèi)生細(xì)菌可能是種苗攜帶或者通過根部侵入。

研究表明細(xì)菌數(shù)量超過群落細(xì)菌數(shù)量1%才可以通過PCR-DGGE檢測出來[20]，因此系統(tǒng)中的弱勢菌群有可能被漏檢，所以香蕉植株具有豐富的內(nèi)生細(xì)菌資源并可能存在未被認(rèn)知的新物種。對18條帶進(jìn)行切膠回收并克隆測序，分別屬于7個(gè)細(xì)菌類群，其中變形桿菌門（ Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）類群與脹果甘草內(nèi)生細(xì)菌的菌群比較相似[21]。放線菌是一類重要的生防菌類群，曹理想等[22]用傳統(tǒng)分離方法研究香蕉內(nèi)生放線菌和真菌多樣性，共分離156株內(nèi)生放線菌，優(yōu)勢菌株與本研究結(jié)果不同，本研究所測序得到的放線菌類中是否存在香蕉枯萎病菌的拮抗放線菌，仍需深入研究。綠彎菌門（Chloroflexi）等幾個(gè)類群均為不可培養(yǎng)細(xì)菌[23]，香蕉內(nèi)生細(xì)菌研究中還未見報(bào)道。在所得香蕉植株內(nèi)生細(xì)菌中，藍(lán)細(xì)菌門Cyanobacteriu的有關(guān)菌占35%，為優(yōu)勢菌群。研究中發(fā)現(xiàn)香蕉植株發(fā)病后所出現(xiàn)的特征條帶，分別為5、9、11、13和17號帶，這些特有條帶80%為藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteri）的細(xì)菌。有報(bào)道稱藍(lán)細(xì)菌與蘇鐵[24]、小葉滿江紅[25]等低等植物形成共生固氮體系，藍(lán)細(xì)菌與香蕉的相互關(guān)系還未見報(bào)告。藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteri）、變形桿菌門（ Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、綠菌門等不可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的作用及與寄主植物之間的相互關(guān)系，還有待進(jìn)一步研究。

PCR-DGGE方法研究植物內(nèi)生細(xì)菌多樣性，初步揭示香蕉植株感染枯萎病菌前后的內(nèi)生細(xì)菌的種類以及不同組織種類的變化情況。這種PCR-DGGE的方法可用于確定不能進(jìn)行純培養(yǎng)的內(nèi)生細(xì)菌的種類，與以往分離培養(yǎng)直接形態(tài)觀察的方法相比，擴(kuò)大了人們對內(nèi)生細(xì)菌的研究視野，豐富了內(nèi)生細(xì)菌資源，可以提供更多的內(nèi)生細(xì)菌種群信息。DGGE的方法有助于深入了解病原菌與內(nèi)生細(xì)菌之間在寄主植物中相互作用的關(guān)系，從而為植物病害的防治提供新的思路。

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