摘 要: 利用開發(fā)的11對(duì)EST-SSR引物分析了33份獼猴桃種質(zhì)資源的遺傳多樣性及其遺傳關(guān)系。結(jié)果表明，11對(duì)EST-SSR引物在所有供試材料中均可擴(kuò)增出清晰條帶，其中有8對(duì)引物呈現(xiàn)多態(tài)性，多態(tài)性擴(kuò)增率為72.7%，對(duì)33份種質(zhì)材料的區(qū)分率達(dá)100 %。8對(duì)多態(tài)性引物共檢測(cè)到61個(gè)等位基因，每對(duì)引物可檢測(cè)到的等位基因數(shù)為2-17，平均為7.6個(gè)。利用NTSYS-pc軟件，以不加權(quán)成對(duì)算術(shù)平均法（UPGMA）對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行聚類，譜系圖顯示，33份種質(zhì)材料之間的相似系數(shù)在0.60～0.97，表明獼猴桃種質(zhì)之間遺傳關(guān)系相對(duì)來說不是很遠(yuǎn)。在相似系數(shù)0.73的水平上可將供試獼猴桃材料分為7個(gè)類群，其結(jié)果與傳統(tǒng)的形態(tài)分類大體一致。從分子角度揭示了獼猴桃種質(zhì)資源的遺傳多態(tài)性及其遺傳關(guān)系?？蔀楂J猴桃種質(zhì)改良提供理論依據(jù)。EST-SSR是非常有效和可靠的分子標(biāo)記，可為獼猴桃分子育種及遺傳連鎖圖構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞: 獼猴桃； EST-SSR； 種質(zhì)資源； 遺傳分析

中圖分類號(hào)：Ｓ６６3．4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：Ａ 文章編號(hào)：１００９－９９８０（２０12）０2－0212－０5

Genetic relationships from Kiwifruit germplasms based on EST-SSR markers

XU Xiao-biao，LIAO Jiao，HUANG Chun-hui，GU Qing-qing，QU Xue-yan，LIU Shan-jun，CHEN Jin-yin

（College of Agronomy，Jiangxi Agricultural University，Nanchang， Jiangxi 330045 China）

Abstract: Eleven pairs of EST-SSR markers developed and designed by our lab were used to amplify the genomic DNA isolated from 33 kiwifruit genotypes (Actinidia spp.) in order to analyze their genetic diversity and relationship. The results showed that the clear DNA fragments were amplified for all materials tested by using 11 pairs of EST-SSR primers， and 8 of them showed polymorphic， accounting for 72.7%， the identification rates of 33 germplasms were up to 100%. Totally， 61 alleles were detected by 8 polymorphic pairs of EST-SSR primers， and 2 to 17 (mean 7.6) by each polymorphic primer set. Then Cluster analysis results by NTSYS-pc software based on Unweighted pair-group method arithmetic average (UPGMA) showed that the Dice similarity coefficients of 33 germplasms in kiwifruit ranged from 0.60 to 0.97， which suggested that their genetic relationships were relatively near. Thirty three accessions could be divided into seven groups according to the Dice similarity coefficient 0.73， which was consistent with the traditional classification to a certain degree. The research could reflect the kiwifruit genetic variation on molecular level by EST-SSR markers and provide theoretical basis for kiwifruit breeding. It is suggested that EST-SSR markers are very effective to evaluate DNA polymorphism and genetic diversity in kiwifruit germplasms，and will provide theoretical information for molecular breeding and genetic mapping in kiwifruit.

Key words: Kiwifruit （Actinidia spp.）； EST-SSR； Germplasm resources； Genetic analysis

獼猴桃（Actinidia Lindl.）是20世紀(jì)野生果樹人工馴化栽培最有成就的四大果種之一[1]。由于其風(fēng)味獨(dú)特，營(yíng)養(yǎng)豐富，維生素C含量高，經(jīng)濟(jì)價(jià)值和醫(yī)療效果好， 被譽(yù)為“果中之王”，深受消費(fèi)者青睞。雖然獼猴桃產(chǎn)量的提高與品質(zhì)的改善在相當(dāng)程度上依靠品種更新，但在生產(chǎn)上優(yōu)良品種推廣滯后，品種間遺傳背景狹窄，遺傳資源多樣性受到不同程度的破壞。因此，進(jìn)行獼猴桃種質(zhì)遺傳多樣性研究對(duì)于良種選育與產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重大意義。

近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者分別運(yùn)用SSR[2-4]、RAPD[5]、AFLP[6]等分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)獼猴桃種質(zhì)遺傳多樣性與親緣關(guān)系進(jìn)行了相關(guān)研究。此外。寧允葉等[7]利用RAPD技術(shù)對(duì)紅陽(yáng)獼猴桃資源進(jìn)行了分析，并篩選鑒定了全紅芽變系。董曉莉等[8]采用RAPD技術(shù)研究彩色獼猴桃與美昧獼猴桃的遺傳多樣性，結(jié)果表明彩色獼猴桃和美昧獼猴桃具有復(fù)雜的遺傳關(guān)系，它們除了變種間具有較大的遺傳差異外，變種內(nèi)也存在一定的遺傳差異。UPGMA法聚類結(jié)果與傳統(tǒng)的形態(tài)分類存在一定的差異．但部分反映了獼猴桃的地理分布。CHEN等[9]從64對(duì)AFLP引物篩選出4對(duì)引物，對(duì)31份獼猴桃種質(zhì)材料進(jìn)行檢測(cè)，得到190個(gè)擴(kuò)增基因位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)179個(gè)，多態(tài)性比例為94.2%，對(duì)31份種質(zhì)材料的區(qū)分率達(dá)到100 %。然而，由于獼猴桃開發(fā)的分子標(biāo)記種類和數(shù)量有限，故尚需開發(fā)更多的分子標(biāo)記類型應(yīng)用于獼猴桃種質(zhì)遺傳多樣性和遺傳圖譜等研究。

目前，新型的EST-SSR標(biāo)記已成為重要農(nóng)藝性狀定位、基因作圖、遺傳多樣性、比較基因組學(xué)研究的新型重要工具[10]。EST-SSR標(biāo)記具有信息量大、通用性好、開發(fā)簡(jiǎn)單快捷、費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)，是一種有效和可靠的分子標(biāo)記。在一些果樹中已建立了EST-SSR標(biāo)記，并被證明具有多方面的利用價(jià)值和功能性[11]。但EST-SSR 標(biāo)記在獼猴桃種質(zhì)資源遺傳多樣性方面的研究尚未見報(bào)道。據(jù)此，本研究應(yīng)用EST-SSR標(biāo)記對(duì)獼猴桃種質(zhì)資源進(jìn)行分析，篩選獼猴桃多態(tài)性的分子標(biāo)記，揭示其遺傳多樣性水平，以期為獼猴桃資源保育與遺傳改良奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

本試驗(yàn)采取了33份獼猴桃種質(zhì)（表1）進(jìn)行遺傳多樣性評(píng)價(jià)與遺傳關(guān)系分析，供試材料均采自中國(guó)科學(xué)院武漢植物研究所獼猴桃國(guó)家種質(zhì)資源圃。

采集新鮮嫩葉用硅膠干燥保存提取基因組DNA，采用CTAB法[12]加以改進(jìn)[13]。在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，將DNA模板濃度調(diào)至10 mmol·L-1，-20 ℃保存?zhèn)溆谩CR反應(yīng)為20 μL 反應(yīng)體系，含2. 0 mmol·L-1 Mg2+，0. 25 mmol·L-1 dNTP，0.3 μmol·L-1的引物，60 ngDNA，Taq DNA 酶1U。反應(yīng)程序?yàn)? 94 ℃預(yù)變性3 min，然后進(jìn)入循環(huán)，94 ℃變性30 s，適宜溫度退火30 s，72 ℃ 延伸45 s，循環(huán)次數(shù)為35。72 ℃延伸240 s，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用8%丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，硝酸銀染色顯影，掃描圖像保存至電腦。50 bp DNA ladder為參照，估算擴(kuò)增產(chǎn)物分子量。

分析丙烯酰胺凝膠電泳圖片，圖譜中的每一條帶（DNA片段）作為一個(gè)分子標(biāo)記，每條多態(tài)性帶可視為一個(gè)等位基因，根據(jù)各分子標(biāo)記的遷移率及其有無計(jì)算所有位點(diǎn)的二元數(shù)據(jù)，有帶記為“1”，無帶記為“0”。輸入生成矩陣，計(jì)算各獼猴桃種間的遺傳相似系數(shù)。利用NTSYS-pc軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以不加權(quán)成對(duì)算術(shù)平均法（UPGMA）對(duì)材料進(jìn)行聚類。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物的多態(tài)性及其揭示的遺傳多樣性

利用本實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的11對(duì)EST-SSR引物對(duì)33份獼猴桃材料進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其在所有供試材料中均可擴(kuò)增出清晰條帶，有效擴(kuò)增率為100%。其中有8對(duì)引物（Acd05、Acd08、Acd11、Ad002、Acd001、Acd035、Acd037、Acd083）呈現(xiàn)多態(tài)性，多態(tài)性擴(kuò)增率為72.7%。

進(jìn)一步運(yùn)用該8對(duì)多態(tài)性EST-SSR擴(kuò)增引物對(duì)33份獼猴桃種質(zhì)的遺傳多樣性及其遺傳關(guān)系進(jìn)行評(píng)價(jià)與分析。結(jié)果表明，供試的8對(duì)EST-SSR引物擴(kuò)增多態(tài)性明顯，在33份獼猴桃材料中共檢測(cè)出61個(gè)等位變異（表2）。每對(duì)引物所揭示的等位基因數(shù)明顯不同，所檢測(cè)的等位基因數(shù)變化于2~17之間，平均為7.6個(gè)。

2.2 獼猴桃種質(zhì)資源的聚類分析

根據(jù)材料間的相似系數(shù)，采用UPGMA法對(duì)33份獼猴桃種質(zhì)進(jìn)行聚類（圖1）。在遺傳相似系數(shù)為0.73的水平上可將33份獼猴桃材料聚為7類，其中粗葉獼猴桃單獨(dú)聚在為類（A類），葛棗獼猴桃、黒蕊獼猴桃、軟棗獼猴桃聚在一類（B類）。禿果毛花獼猴桃、毛花獼猴桃及白色毛花獼猴桃聚為一類（C）。網(wǎng)脈獼猴桃、黃毛獼猴桃、小葉獼猴桃及闊葉獼猴桃聚為一類（D）。刺毛獼猴桃、中越獼猴桃、紫果獼猴桃及白背葉獼猴桃為一類（E）。F類包括棕毛獼猴桃、狗棗獼猴桃、梅葉獼猴桃、四萼獼猴桃、大籽獼猴桃、對(duì)萼獼猴桃及團(tuán)葉獼猴桃。其余材料聚為G類。在G類中，異色獼猴桃與京梨獼猴桃、漓江獼猴桃與大花獼猴桃親緣關(guān)系較近。硬齒獼猴桃的變種異色獼猴桃與京梨獼猴桃聚為一類，但未能與硬齒獼猴桃的另一變種毛葉硬齒獼猴桃聚為一類，說明該種內(nèi)具有較大的遺傳變異，這與該種在形態(tài)上較復(fù)雜的多態(tài)性相一致。

3 討 論

目前，作為一種新型的EST-SSR標(biāo)記，已在葡萄[14]、梨[15]、柑橘[16]、扁桃[17]、香蕉[18]等多種果樹的遺傳多樣性和系統(tǒng)學(xué)研究、獼猴桃[19]連鎖標(biāo)記篩選、蘋果[20]、草莓[21]、柑橘與枳殼[22]、以及獼猴桃[23]遺傳圖譜構(gòu)建等方面有相關(guān)研究。本研究中采用優(yōu)越而高效的基于EST的SSR標(biāo)記技術(shù)，對(duì)33份獼猴桃種質(zhì)資源的遺傳多樣性進(jìn)行分析。其中篩選出8對(duì)EST-SSR引物呈現(xiàn)多態(tài)性，多態(tài)性擴(kuò)增率為72.7%，對(duì)33份供試材料的區(qū)分率達(dá)100%，共檢測(cè)到61個(gè)等位基因，每對(duì)引物可檢測(cè)到的等位基因數(shù)為2~17種。通過UPGMA聚類，在遺傳相似系數(shù)為0.73的水平上可將33份獼猴桃材料聚為7類，其結(jié)果與傳統(tǒng)的形態(tài)分類大體一致。本實(shí)驗(yàn)采用11對(duì)EST-SSR引物對(duì)33份獼猴桃種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，其中有8對(duì)引物在供試材料中都有擴(kuò)增產(chǎn)物，且均能擴(kuò)增出多態(tài)性，可能由于引物設(shè)計(jì)時(shí)選用了SSR重復(fù)次數(shù)較高的EST，這就增大了引物在不同材料間的多態(tài)性擴(kuò)增率，提高了EST-SSR標(biāo)記在資源分析中的效率。研究結(jié)果從分子水平上解釋了這些種質(zhì)資源的遺傳多樣性水平。

中國(guó)是獼猴桃的起源和分布中心，種質(zhì)資源極為豐富[24]。全世界獼猴桃共有75種，125個(gè)分類群（變種或變型）[25]。傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類將獼猴桃屬植物分為4類，分別是凈果組、斑果組、星毛組和糙毛組[26]。本研究在D=0.73的水平上將供試材料分為7大類，其中凈果組中的狗棗獼猴桃、梅葉獼猴桃、四萼獼猴桃、大籽獼猴桃、對(duì)萼獼猴桃、團(tuán)葉獼猴桃聚為一類，紫果獼猴桃和白背葉獼猴桃聚為一類，而軟棗獼猴桃、黒蕊獼猴桃、葛棗獼猴桃聚為一類。星毛組中的漓江獼猴桃、大花獼猴桃、井岡山獼猴桃、湖北獼猴桃、江西獼猴桃、繁花獼猴桃、安息香獼猴桃聚為一類，黃毛獼猴桃、小葉獼猴桃、闊葉獼猴桃聚為一類，禿果毛花獼猴桃、白色毛花獼猴桃與毛花獼猴桃聚為一類。斑果組中異色獼猴桃、京梨獼猴桃、毛葉硬齒獼猴桃聚為一類。而凈果組中紫果獼猴桃和白背葉獼猴桃，軟棗獼猴桃、黒蕊獼猴桃和葛棗獼猴桃分別聚類；星毛組中的黃毛獼猴桃、小葉獼猴桃與闊葉獼猴桃，禿果毛花獼猴桃、白色毛花獼猴桃與毛花獼猴桃分別聚為一類，這可能是在異位保育下生態(tài)環(huán)境改變導(dǎo)致種間或變種間產(chǎn)生分化，本研究結(jié)果與傳統(tǒng)的形態(tài)分類大體一致。

本研究首次應(yīng)用新型EST-SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)獼猴桃種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性評(píng)價(jià)，結(jié)果證實(shí)EST-SSR標(biāo)記具有開發(fā)簡(jiǎn)便及成本低廉等優(yōu)點(diǎn)， EST-SSR標(biāo)記對(duì)獼猴桃種質(zhì)資源的多態(tài)性評(píng)價(jià)及遺傳變異分析有效、穩(wěn)定和可靠，可為獼猴桃分子育種、遺傳改良及功能基因組研究奠定基礎(chǔ)。

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