摘 要: 為研究早實(shí)核桃品種的抗寒性，以14個(gè)早實(shí)核桃品種為試材，采用印跡法和石蠟制片技術(shù)觀測了10項(xiàng)葉片組織結(jié)構(gòu)指標(biāo)，應(yīng)用變異系數(shù)、相關(guān)分析和聚類分析對葉片組織結(jié)構(gòu)指標(biāo)進(jìn)行了篩選，采用隸屬函數(shù)對各品種的抗寒性進(jìn)行了綜合評價(jià)。結(jié)果表明，葉片厚度、氣孔密度和柵/海比是影響抗寒性的主要葉片組織結(jié)構(gòu)指標(biāo)；14個(gè)品種抗寒性強(qiáng)弱排序?yàn)? 西林2號>契可>溫185>強(qiáng)特勒>維納>魯光>吐來爾>遼核3號>遼核4號>西扶2號>中林5號>遼核1號>香玲>西林3號?？购灶愋蛣澐譃?類: 西林2號為高抗寒類型；契可和溫185為抗寒類型；強(qiáng)特勒、維納、魯光、吐來爾、遼核3號和遼核4號為中抗寒類型；西扶2號、中林5號和遼核1號為低抗寒類型；香玲和西林3號為不抗寒類型。

關(guān)鍵詞: 早實(shí)核桃； 葉片組織結(jié)構(gòu)； 抗寒性； 綜合評價(jià)

中圖分類號：Ｓ６６4．1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：Ａ 文章編號：１００９－９９８０（２０12）０2－0205－０7

Cold resistance division based on leaf tissue structure of early-fruiting walnut cultivars

LIU Du-ling1， ZHANG Bo-yong1， PENG Shao-bing1，ZHU Hai-lan1，LIU Shu-ming2*， DU Ting1

（1College of Forestry， Northwest A F University， Yangling， Shaanxi 712100 China； 2College of Science， Northwest AF University， Yangling， Shaanxi 712100 China)

Abstract: To study cold resistance of early-fruiting walnut cultivars， 14 early-fruiting varieties were used as experimental materials， and 10 leaf tissue structure indexes were observed by using blotting methods and paraffin section methods. Leaf tissue structure indexes were screened via coefficient of variation， analysis of correlation and hierarchical cluster analysis， and comprehensive evaluation on cold resistance for each variety was done by subordinate function . The results showed that leaf thickness， stomata density and the ratio between palisade tissue and spongy tissue were the main factors related to the hardiness；the cold resistance for 14 cultivars was in order of Xilin No. 2>Chico>Wen185>Vina>Chandler >Liaohe No. 3> Tulare >Luguang>Liaohe No.4>Xifu No. 2>Zhonglin No. 5>Xiangling>Xilin No. 3>Liaohe No. 1；according to the cold hardiness， the cultivars could be divided into 5 groups: Xilin No. 2 with high cold resistance; Chico and Wen185 with cold resistance ; Chandler， Vina， Luguang， Tulare， Liaohe No. 3 and Liaohe No.4 with medium cold resistance；Xifu No. 2， Zhonglin No. 5 and Liaohe No.1 with low cold-tolerance; Xiangling and Xilin No. 3 without cold resistance.

Key words: Early-fruiting walnut； Leaf tissue structure； Cold resistance； Comprehensive evaluation

核桃（Juglans regia L.）是主要的干果和木本油料樹種， 是我國重要的傳統(tǒng)出口商品。核桃果實(shí)營養(yǎng)豐富，其營養(yǎng)價(jià)值和保健作用越來越為人們所認(rèn)識。隨著人們生活水平的不斷提高，對核桃的需求量日趨增多，核桃栽培面積迅速擴(kuò)大。但我國北方核桃產(chǎn)區(qū)普遍存在倒春寒、晚霜危害，使核桃雌、雄花芽、幼嫩新梢嚴(yán)重受凍，造成核桃產(chǎn)量大幅度降低甚至絕收[1-2]，嚴(yán)重地制約著核桃產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益的提高，進(jìn)而影響核桃生產(chǎn)的發(fā)展。因此，研究核桃的抗寒性，對于今后核桃生產(chǎn)的發(fā)展具有重要的意義。我們對14個(gè)早實(shí)核桃品種進(jìn)行葉片解剖結(jié)構(gòu)觀測比較，綜合評價(jià)早實(shí)核桃不同品種的抗寒性，旨在為核桃抗寒品種選育、引種栽培及適栽區(qū)劃分提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

試材為早實(shí)核桃14個(gè)品種: 西林2號、西林3號、遼核1號、遼核3號、遼核4號、西扶2號、中林5號、溫185、香玲、魯光、維納、契可、吐來爾和強(qiáng)特勒，樹齡5～7 a，環(huán)境條件、管理?xiàng)l件基本一致。

1.2 方法

1.2.1 采樣及處理 于2009年7月16日在興平市馬嵬鎮(zhèn)核桃良種采穗圃，每品種選擇3個(gè)生長勢基本一致的單株，在每單株樹冠同方向、同部位摘取同一節(jié)位充分成熟的小葉5枚（共15枚）。每個(gè)品種取5枚葉片用于氣孔觀察，其余10枚以主脈中部為中心，切取1 cm×1 cm小塊，F(xiàn)AA液固定，后保存于70%的酒精中備用。

1.2.2 石蠟制片及葉片解剖結(jié)構(gòu)觀測 采用石蠟切片法制片[3]，酒精梯度脫水，浸蠟包埋，用LeicaRM切片，切片厚度8 μm，番紅-固綠雙重染色，中性樹膠封藏，制成裝片。裝片用Motic顯微鏡及Motic顯微成像系統(tǒng)觀察，20倍鏡下照相。利用圖像處理軟件Photoshop CS 3.0按像素測定其葉片厚度、上表皮厚度、下表皮厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度（單位: μm），計(jì)算柵/海比、細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密度（CTR）和細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松度（SR），所有測量數(shù)據(jù)均為30個(gè)視野的平均值。計(jì)算公式為:

柵/海比=柵欄組織厚度/海綿組織厚度

細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密度（CTR）=柵欄組織厚度/葉片厚度×100

細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松度（SR）=海綿組織厚度/葉片厚度×100

1.2.3 葉表皮制片及氣孔觀測 采用印跡法[4]制片，中性樹膠封片。用Motic顯微鏡及Motic顯微成像系統(tǒng)觀察， 40倍鏡下照相。利用圖像處理軟件Photoshop CS 3.0按像素進(jìn)行測量，觀測氣孔長度（APL）和氣孔密度（SD），每個(gè)觀測指標(biāo)值均為30個(gè)視野的平均值。

氣孔長度（APL）——?dú)饪灼鲀蓚€(gè)腎形保衛(wèi)細(xì)胞結(jié)合處的長度（ μm）。

氣孔密度（SD）——每個(gè)視野單位面積氣孔器的個(gè)數(shù)（個(gè)/mm2）。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)分析采用Excel和 SPSS 17.0軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 早實(shí)核桃不同品種葉片組織結(jié)構(gòu)特征比較

2.1.1 早實(shí)核桃不同品種葉肉組織結(jié)構(gòu)特征比較

葉片厚度常作為植物抗寒性指標(biāo)之一，越厚則水分散失越慢，在寒冷的外界環(huán)境下可延緩葉片受低溫的損害程度。由表1可看出，各品種葉片厚度254.17~364.15 μm，品種間葉片厚度差異極顯著，不同品種葉片厚度由大到小依次為: 遼核1號>西林2號>強(qiáng)特勒>遼核4號>維納>溫185>魯光>遼核3號>西扶2號>中林5號>吐來爾>西林3號>契可>香玲。

從核桃葉片橫切面圖可見（圖版Ⅰ），各品種葉肉細(xì)胞有明顯柵欄組織和海綿組織分化，為典型的異面葉?？拷S面的柵欄組織細(xì)胞為長柱狀，細(xì)胞間隙較小，細(xì)胞分層排列緊密且較規(guī)則。海綿組織細(xì)胞位于柵欄組織和下表皮之間，多為短柱狀，相互連接成網(wǎng)，但排列密集程度各品種不一。柵欄組織細(xì)胞內(nèi)含葉綠體數(shù)目較多，分布也比較均勻，海綿組織細(xì)胞內(nèi)葉綠體數(shù)目相對較少。

從測定結(jié)果看出（表1），14個(gè)核桃品種的葉肉組織結(jié)構(gòu)指標(biāo)之間均存在極顯著差異。早實(shí)核桃多數(shù)品種柵欄組織為2層（吐來爾、契可、強(qiáng)特勒為2～3層），第1、2層?xùn)艡诮M織細(xì)胞排列緊密，第3層細(xì)胞排列相對疏松，與海綿組織區(qū)分不太明顯。柵欄組織厚度117.5~160.4 μm，平均厚度為140.08 μm。溫185柵欄組織厚度最大，在 160 μm以上，香玲和西林3號最小，不到120 μm。各品種海綿組織均排列疏松（圖版Ⅰ）。海綿組織厚度89.10~162.80 μm，平均厚度為118.62 μm，西林3號海綿組織最厚，為162.80 μm，契可海綿組織厚度最小，海綿組織細(xì)胞排列明顯比其他品種密集。

各品種柵/海比為0.90~1.49，契可柵/海比最大，為1.49，遼核1號最小，為0.90。CTR值為0.52~0.40，溫185的CTR值最大，遼核1號最小。SR值為0.34~0.45，遼核1號SR值最大，契可最小。

2.1.2 早實(shí)核桃不同品種表皮組織結(jié)構(gòu)特征比較

表皮是植物的保護(hù)組織，是植物抵御不良環(huán)境的屏障[5]。表皮包括上表皮和下表皮。由圖版Ⅱ可知，早實(shí)核桃表皮均由單層細(xì)胞構(gòu)成，其外被角質(zhì)層，上表皮細(xì)胞扁平方形，排列緊密，下表皮細(xì)胞不規(guī)則，沒有空隙。從測定結(jié)果表1看，早實(shí)核桃各品種葉片表皮特征各異。除遼核3號、西扶2號、溫185、香玲外，其他品種的上表皮均厚于下表皮；各品種上、下表皮厚度差異極顯著；上表皮厚度28.27~15.35 μm，遼核1號上表皮明顯厚于其他品種，西林3號上表皮明顯薄于其他品種；下表皮厚度21.17~11.49 μm，香玲下表皮最厚，西林3號最薄。早實(shí)核桃上表皮沒有氣孔分布，下表皮散生有大量氣孔。氣孔平置，為不定式， 卵圓形或長圓形。氣孔器由2個(gè)腎形的保衛(wèi)細(xì)胞構(gòu)成，形狀相似（圖版Ⅱ）。各品種的氣孔特征存在極顯著差異（表1），早實(shí)核桃氣孔器形小而密集，平均長度為32.84 μm，平均密度為227.30個(gè)·mm-2。西林2號和吐來爾氣孔最長（在35.00 μm以上），遼核3號氣孔最短（在 30.00 μm以下）。遼核1號和西扶2號的氣孔密度最大（在290.00個(gè)·mm-2以上），西林2號和契可的氣孔密度最?。ㄔ?50.00個(gè)·mm-2以下）。

2.2 早實(shí)核桃品種抗寒性綜合評價(jià)

2.2.1 葉片抗寒性組織結(jié)構(gòu)指標(biāo)篩選 只有選擇彼此獨(dú)立的、具有代表性的指標(biāo)才能獲得抗寒性評價(jià)的最優(yōu)方案。對14個(gè)早實(shí)核桃10項(xiàng)葉片解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)進(jìn)行聚類分析。

從圖1可以看出，10項(xiàng)葉片組織結(jié)構(gòu)指標(biāo)聚為3類時(shí)，各類間的距離比較大，說明各類特點(diǎn)比較突出，相關(guān)性較小。第1類包括葉片厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度、葉片組織結(jié)構(gòu)疏松度（SR）、上表皮厚度和氣孔長度（APL）；第2類包括下表皮厚度和氣孔密度（SD）；第3類包括柵/海比和葉片組織結(jié)構(gòu)緊密度（CTR）。各類中典型指標(biāo)的選擇根據(jù)相關(guān)指數(shù)的大小確定，相關(guān)指數(shù)計(jì)算公式為:

R2i為每類中每個(gè)指標(biāo)的相關(guān)指數(shù)，n為每類中指標(biāo)個(gè)數(shù)，i=1，2，…n， r為同類中某指標(biāo)與其他指標(biāo)間的相關(guān)系數(shù)（表2）。指標(biāo)的相關(guān)指數(shù)越大，代表性越強(qiáng)。

根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，如果選入了葉片結(jié)構(gòu)變異過小的指標(biāo)，不僅不會(huì)使分析結(jié)果準(zhǔn)確、合理，反而給分析帶來不便。一般在一組指標(biāo)中變異系數(shù)大的指標(biāo)對分析結(jié)果具有重要意義。由表3知，第1類中，葉片厚度的相關(guān)指數(shù)最大，確定為該類的典型指標(biāo)；第2類中，下表皮厚度與氣孔密度相關(guān)指數(shù)相等，氣孔密度變異系數(shù)，17.84%（表1）較大，故選氣孔密度；第3類中，柵/海比和CTR相關(guān)指數(shù)相等（表3），但柵/海比的變異系數(shù)大，12.45%（表1），故選擇柵/海比。

2.2.2 早實(shí)核桃不同品種抗寒性綜合評價(jià) 對篩選的3項(xiàng)葉片抗寒性解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)（葉片厚度、氣孔密度、柵/海比），應(yīng)用隸屬函數(shù)法，對早實(shí)核桃14個(gè)品種的抗寒性進(jìn)行綜合評價(jià)。隸屬函數(shù)值計(jì)算公式為:

Uij式中表示i種類j指標(biāo)的抗寒隸屬函數(shù)值；Xij表示i種類j指標(biāo)的測定值；Xjmim表示所有種類j指標(biāo)的最小值；Xjmix表示所有種類j指標(biāo)的最大值；i表示某個(gè)品種；j表示某項(xiàng)指標(biāo)。如果某一指標(biāo)與核桃抗寒性呈負(fù)相關(guān)， 則利用反隸屬函數(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)換， 計(jì)算公式為:

根據(jù)此公式計(jì)算出各品種3項(xiàng)指標(biāo)的平均隸屬度，以平均隸屬度評價(jià)早實(shí)核桃品種的抗寒性，平均隸屬度越大，抗寒性越強(qiáng)。

按平均隸屬度大?。ū?），對早實(shí)核桃品種抗寒性強(qiáng)弱排序?yàn)? 西林2號>契可>溫185>強(qiáng)特勒>維納>魯光>吐來爾>遼核3號>遼核4號>西扶2號>中林5號>遼核1號>香玲>西林3號。按照平均隸屬度將14個(gè)早實(shí)核桃品種抗寒性劃分為5類: 0.70~1.00為高抗寒類型（High Resistance， HR）， 有西林2號；0.60~0.69為抗寒類型（Resistance， R）， 有契可和溫185；0.40~0.59為中抗寒類型（Middle Resistance， MR），有強(qiáng)特勒、維納、魯光、吐來爾、遼核3號和遼核4號；0.30~0.39為低抗寒類型（Lower Resistance， LR）， 有西扶2號、中林5號和遼核1號；0~0.29為不抗寒類型（Susceptible， S），有香玲、西林3號。

3 討 論

關(guān)于植物形態(tài)組織結(jié)構(gòu)與抗寒性的關(guān)系，早在1904年Blinn[6]就指出，可根據(jù)品種之間形態(tài)差異來區(qū)分其抗寒性。葉是植物抗寒最敏感的器官，有關(guān)葉片形態(tài)組織結(jié)構(gòu)與抗寒性關(guān)系的研究在許多經(jīng)濟(jì)林樹種[5，7-9]已有報(bào)道。一般認(rèn)為，CTR 、SR和柵/ 海比是指示抗寒性強(qiáng)弱的重要指標(biāo)。 CTR、柵/ 海比與抗寒性呈正相關(guān)，SR與抗寒性呈負(fù)相關(guān)[8-10]。本研究應(yīng)用相關(guān)分析、變異系數(shù)和聚類分析從10項(xiàng)葉片解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)中選擇出指示早實(shí)核桃抗寒性的3項(xiàng)指標(biāo): 氣孔密度、葉片厚度和柵/海比。氣孔密度作為抗寒性指標(biāo)與李國華等[5]在澳洲堅(jiān)果上的研究結(jié)果一致，柵/海比作為抗寒性指標(biāo)與吳林等[7]在越橘、王奎玲等[9]在耐冬山茶上的研究結(jié)果一致，而葉片厚度作為抗寒性指標(biāo)與前人[5，8]的研究結(jié)果不一致。李國華等[5]和彭偉秀等[8]認(rèn)為，單一組織的數(shù)量（如葉片總厚度、柵欄組織厚度或海綿組織厚度） 往往會(huì)隨樣品所處生態(tài)條件和生理狀態(tài)的不同而發(fā)生變化，沒有一定的穩(wěn)定性， 不能很好反映品種間抗寒性在遺傳上的差異， 作為不同品種抗寒性的形態(tài)學(xué)指標(biāo)可靠性不強(qiáng)。因此，葉片厚度作為早實(shí)核桃抗寒性指標(biāo)還有待于進(jìn)一步研究。

本研究應(yīng)用隸屬函數(shù)法，對14種早實(shí)核桃品種的抗寒性進(jìn)行了綜合評價(jià)， 其強(qiáng)弱排序?yàn)? 西林2號>溫185>契可>維納>強(qiáng)特勒>遼核3號>吐來爾>魯光>遼核4號>西扶2號>中林5號>香玲>西林3號>遼核1號。根據(jù)平均隸屬度將14個(gè)品種劃分為5個(gè)抗寒類型。第1類為高抗寒類型，有西林2號；第2類為抗寒類型，有契可和溫185；第3類為中抗寒類型，有強(qiáng)特勒、維納、魯光、吐來爾、遼核3號和遼核4號；第4類為低抗寒類型，有西扶2號、中林5號和遼核1號；第五類為不抗寒類型，有香玲、西林3號。

抗寒性是從植物形態(tài)解剖構(gòu)造，水分生理生態(tài)特征及生理生化反應(yīng)到組織細(xì)胞，光合器官乃至原生質(zhì)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的綜合反映[11]。因此只有從其抗寒形態(tài)結(jié)構(gòu)特征、抗寒生理生化特征及核桃的生長狀況等方面，采用多指標(biāo)綜合評價(jià)，才能客觀地反映核桃的抗寒性[12-13]。本研究利用篩選的3項(xiàng)葉片解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)對早實(shí)核桃抗寒性進(jìn)行了初步評價(jià)，要準(zhǔn)確評價(jià)核桃的抗寒性，還需結(jié)合抗寒生理生化指標(biāo)，田間凍害情況及凍害后生長恢復(fù)情況等加以綜合考慮。

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