2西北農(nóng)林科技大學(xué)·旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100）

摘 要：以歐洲葡萄無核白品種（Vitis vinifera cv. Thompson Seedless）為研究材料，根據(jù)霞多麗品種脫水素基因序列設(shè)計(jì)引物并PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物用地高辛標(biāo)記并Southern雜交分析，發(fā)現(xiàn)無核白基因組含有2個(gè)不同的脫水素基因。設(shè)計(jì)并采用一種基于對瓊脂糖凝膠梯狀切割回收的方法克隆這2個(gè)不同脫水素基因的DNA片段，分別命名為DHN1-L和DHN1-S。進(jìn)一步用反向PCR法獲得這2個(gè)脫水素基因DNA片段的側(cè)翼序列，獲得基因DNA全長序列（NCBI登錄號分別為EF371882和EF371881）。與已公布葡萄基因組序列比對，這2個(gè)基因位于第4號染色體相同位置，為等位基因，說明無核白品種脫水素基因?yàn)殡s合體。2個(gè)脫水素基因所翻譯蛋白在疏水性及三級結(jié)構(gòu)方面有差異。無核白葡萄脫水素基因等位基因DNA序列的獲得為進(jìn)一步分析等位基因變異對植物抗逆性的影響提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞：無核白葡萄； 脫水素基因； 等位基因； 克??； 序列分析

中圖分類號：Ｓ６６3．1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：Ａ 文章編號：１００９－９９８０（２０12）０2－0177－０7

DNA sequencing of alleles of DHN1 in Vitis vinifera cv. Thompson Seedless and their bioinformatics analysis

WU Kang1，2， YANG Ya-zhou1，2， ZHANG Chao-hong1，2*， ZHANG Jian-xia1，2， GUO Cui-ying1，2， WANG Yue-jin1，2

（1College of Horticulture， Northwest A F University/Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops （Northwest Region）， Ministry of Agriculture， Yangling， Shaanxi 712100 China； 2State Key Laboratory of Crop Stress Biology in Arid Areas ·Northwest AF University， Yangling， Shaanxi 712100 China）

Abstract: According to the DHN1 sequence （NCBI accession number: AY706989） in Vitis vinifera cv. Chardonnay， primer pairs of VDE-F and VDE-R were designed for PCR amplification. Then the PCR amplicon was modified by digoxin for Southern blot assay. It was found that Vitis vinifera cv. Thompson Seedless bears two similar dehydrin genes. Then， DNA fragments of these two similar DHN1 genes were obtained by the ladder-like purification of agarose gel， and designated as DHN1-L and DHN1-S respectively. Flanking sequences were also obtained by the inverse PCR method （NCBI accession numbers :EF371882 and EF371881 respectively）. BLAST search showed that they located at the same locus （alleles） of chromosome 4 in the grape genome. Bioinformatics analysis showed that there were some differences in hydrophobicity and tertiary structure of the two corresponding encoded proteins. These results would facilitate the ongoing differential functional relevancies of these two alleles in Thompson Seedless in response to the stresses.

Key words: Vitis vinifera cv. Thompson Seedless； Dehydrin gene； Alleles； Clone； Bioinformatics analysis

脫水素屬于LEA蛋白（Late embryogenesis abundant proteins）第二家族成員，在植物抗逆過程中具有重要的功能。多種逆境脅迫，包括低溫、干旱、高鹽都可誘導(dǎo)脫水素基因的大量表達(dá)。很多研究表明脫水素基因的表達(dá)和植物的抗逆性正相關(guān)[1-3]。例如，與野生型擬南芥相比，轉(zhuǎn)小麥脫水素基因的擬南芥植物在高濃度的NaCl或缺水狀態(tài)下表現(xiàn)出更好的生長勢[4]。轉(zhuǎn)玉米脫水素基因的擬南芥植物同樣表現(xiàn)出對滲透脅迫的保護(hù)作用[5]。轉(zhuǎn)大麥脫水素基因的水稻表現(xiàn)出對水分虧缺和鹽脅迫的抗性[6]。

等位基因指位于同源染色體同一基因座位上一個(gè)基因的不同形式[7]。葡萄基因組序列高度雜合，在葡萄基因組中約13%的等位基因序列之間存在差異[8]，而等位基因的結(jié)構(gòu)變異和差異表達(dá)與植株表型多態(tài)性相關(guān)[9-10]。2007年葡萄全基因組序列公布。葡萄全基因組測序是以歐洲葡萄黑比諾（Vitis vinifera cv. Pinot Noir）連續(xù)自交8代得到的株系PN40024為材料，基因組序列較純合，易于測序結(jié)果的拼接和組裝。因?yàn)槠咸讶蚪M測序所選株系的純合性，該全基因組信息不能夠描述葡萄基因組中等位基因之間的序列差異。2006年，Xiao等[11]通過Southern雜交發(fā)現(xiàn)在歐洲葡萄霞多麗（V. vinifera cv. Chardonnay）和河岸葡萄（V. riparia）基因組中有2個(gè)很相似的脫水素基因。通過與葡萄全基因組序列[8]同源比對，可判定這2個(gè)基因位于基因組同一位置，為等位基因。并且這2個(gè)脫水素基因在這2種葡萄中存在差異性的表達(dá)。在低溫、干旱等脅迫條件下，河岸葡萄只表達(dá)其中一種形式的脫水素基因，而在霞多麗葡萄中2種形式的脫水素基因都能夠被誘導(dǎo)表達(dá)[11]。這些結(jié)果說明，這2種不同形式的等位基因在不同葡萄品種之間存在表達(dá)差異。然而，這種等位基因的表達(dá)差異是否與葡萄品種的抗性存在相關(guān)性還有待進(jìn)一步研究。

為進(jìn)一步探索無核白基因組中脫水素等位基因之間是否存在差異。我們通過Southern雜交發(fā)現(xiàn)，在無核白葡萄基因組中存在2種形式的脫水素基因。為了能夠準(zhǔn)確克隆得到這2個(gè)脫水素基因的DNA序列，設(shè)計(jì)出一種簡便實(shí)用的基于瓊脂糖凝膠梯狀回收的方法，并用于克隆這2個(gè)脫水素基因。經(jīng)序列比對發(fā)現(xiàn)，這2個(gè)基因?yàn)榈任换颉＿M(jìn)一步通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，無核白葡萄中脫水素等位基因所翻譯蛋白存在疏水性及三級結(jié)構(gòu)差異。這些研究結(jié)果為進(jìn)一步研究脫水素基因等位基因的功能差異提供了依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 植物材料

以歐洲葡萄品種無核白葡萄（V. vinifera cv. Thompson Seedless）為材料，該品種保存于西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄種質(zhì)資源圃。

1.2 Southern 雜交

通過CTAB法[12]從新鮮葉片中提取基因組DNA。20 μg基因組DNA在37 ℃用限制性內(nèi)切酶（Hind Ⅲ）酶切過夜，酶切產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳過夜（1 V·cm-1，12 h），之后通過毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法將分離產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到Immobilon-Ny+尼龍膜上（Millipore， USA）。根據(jù)霞多麗葡萄脫水素基因序列（NCBI登錄號AY706989）設(shè)計(jì)引物VDE-F：5’-TTGTTGCCGCTTTCATACTC-3’和VDE-R：5’-GACCTATGGACCTAGACTCTCG-3’并進(jìn)行PCR。之后回收PCR產(chǎn)物并進(jìn)行地高辛標(biāo)記。地高辛標(biāo)記試劑盒（Roche，Germany）用于探針標(biāo)記，并按地高辛標(biāo)記試劑盒說明書所提供標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行后續(xù)Southern 雜交。

1.3 梯狀切割及DNA回收

20 μg基因組DNA在37 ℃用限制性內(nèi)切酶（Hind Ⅲ）過夜酶切，酶切產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳過夜（1 V·cm-1，12 h）。電泳后，膠條如圖1-B所示以2.5 mm寬度從下至上連續(xù)切割，共計(jì)30個(gè)凝膠塊。用凝膠回收試劑盒（Tiangen，Beijing）回收每塊膠里面包含的DNA片段，并用紫外分光光度計(jì)定量（A260）。

1.4 基于梯狀回收的PCR

根據(jù)已報(bào)道葡萄脫水素基因序列（NCBI登錄號： AY706987， AY706988，AY706989， AY706990），在保守區(qū)設(shè)計(jì)PCR引物DE-F：5’-TTGTTGCCGCTTTCATACTC-3’和DE-R：5’-CCTTCTCCCAC CTTGCCCAT-3’。對30個(gè)回收樣本進(jìn)行PCR。PCR體系為25 μL，包含：10 ng模板DNA，1×LA緩沖液，1.5 U LA Taq DNA 多聚酶（TaKaRa，Japan），0.4 mmol·L-1 dNTPs，DE-F和DE-R各0.4 μmol·L-1。PCR程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min，然后94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pGEM-T Easy 載體（Promega，USA）。用ABI 3730測序儀（Applied Biosystems，USA）對連接產(chǎn)物測序。

1.5 反向PCR

100 ng基因組DNA酶切產(chǎn)物和PCR陽性樣本在10 μL體系中用3 U T4 DNA連接酶在4 ℃過夜連接。根據(jù)已克隆脫水素基因DNA片段設(shè)計(jì)反向PCR引物rDE-F：5’-TGGTGGGGCTGCTGCTGATGCTC-3’和rDE-R：5’-AGGACGATGGGCAAGGT GG-3’。反向PCR體系為25 μL，包括：1×LA緩沖液，1.5 U LA Taq DNA 多聚酶（TaKaRa，Japan），0.4 mmol·L-1 dNTPs，rDE-F和rDE-R各0.4 μmol·L-1。PCR程序?yàn)椋?4 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s， 65 ℃ 30 s，72 ℃，150 s，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物同樣克隆到pGEM-T Easy 載體（Promega，USA）。用ABI 3730測序儀（Applied Biosystems，USA）測序。

1.6 序列分析

利用Vector NTI的AlignX進(jìn)行序列同源性分析。通過ExPASy中的ProScale（http://us.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl）對蛋白序列做疏水性分析。通過CBS Prediction Servers的CPHmodels（http://www.cbs.dtu.dk/services/CPHmodels/）預(yù)測蛋白三級結(jié)構(gòu)[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 無核白葡萄脫水素基因的Southern 雜交分析

根據(jù)前人[11]的研究結(jié)果，選用Hind III內(nèi)切酶對無核白基因組DNA進(jìn)行酶切。利用脫水素基因編碼區(qū)序列為探針進(jìn)行Southern雜交，結(jié)果如圖1-A所示，雜交結(jié)果出現(xiàn)2條不同大小的雜交條帶，說明無核白基因組中存在2種不同形式的脫水素基因，并且這2個(gè)脫水素基因在瓊脂糖凝膠泳道上被充分分開。

2.2 通過基于瓊脂糖凝膠梯狀回收的方法克隆脫水素基因

為了分析這2個(gè)脫水素基因序列是否一致，一種基于瓊脂糖凝膠梯狀回收的PCR法被用于這2個(gè)脫水素基因DNA片段的克隆。由于這2個(gè)脫水素基因在瓊脂糖凝膠泳道上能夠被充分分開（圖1-A），因此通過對瓊脂糖凝膠泳道連續(xù)切割的方法將這2個(gè)脫水素DNA片段分別回收。將該泳道從下至上以2.5 mm的間隔連續(xù)切割凝膠條（圖1-B），共切割了30塊凝膠塊。分別回收30個(gè)凝膠塊中的DNA片段，最終洗脫體積為20 μL。回收的DNA片段濃度在7~40 mg·L-1（表1）。以回收的DNA樣本為模板，利用脫水素基因保守引物（DE-F和DE-R）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。如圖2-A所示，樣本12，13，14， 19，20和21為PCR陽性，其他泳道為PCR陰性（泳道25~30亦為PCR陰性，在本圖中未顯示）。其中，樣本12，13和14對應(yīng)連續(xù)切割的3個(gè)凝膠塊，樣本19，20和21對應(yīng)另外連續(xù)切割的3個(gè)凝膠塊。該模式可通過圖2-B解釋，當(dāng)DNA片段在電場的作用下在瓊脂糖凝膠泳道上移動時(shí)，不同大小的DNA片段根據(jù)其分子量大小被分開，并且呈從中心位置到兩邊的快速遞減趨勢。因此，瓊脂糖凝膠梯狀切割及DNA回收后，一個(gè)脫水素基因主要被回收到樣本12，13和14中，位于分子量1 200~1 700 bp；另一個(gè)脫水素基因被回收到樣本19，20和21中，位于分子量2 000~3 000 bp（圖1-B）。

對泳道12，13，14，19，20和21的PCR產(chǎn)物分別回收并克隆測序。序列比對表明泳道12，13，14的PCR產(chǎn)物DNA序列相同，將該序列命名為DHN1-S。泳道19，20，21的PCR產(chǎn)物的DNA序列相同，將該序列命名為DHN1-L。DNA序列同源性分析表明，DHN1-S和DHN1-L高度同源，但2者相比，DHN1-L缺失了4 bp的DNA片段，DHN1-S缺失了18 bp的DNA片段（圖4-A）。

2.3 DHN1-S和DHN1-L側(cè)翼序列的獲得

樣本12，13和14對應(yīng)于DHN1-S，樣本19，20和21對應(yīng)于DHN1-L，故只選擇樣本14，20及基因組DNA酶切產(chǎn)物進(jìn)行反向PCR，以便分別得到DHN1-S和DHN1-L的側(cè)翼序列。與基因組DNA酶切產(chǎn)物相比，樣本14和樣本20所含的DNA片段相對較為簡單。因此以樣本14和樣本20的連接產(chǎn)物為模板時(shí)，反向PCR產(chǎn)物應(yīng)當(dāng)更加特異。以基因組DNA的酶切產(chǎn)物的連接產(chǎn)物為模板時(shí)，反向PCR產(chǎn)物除最亮的目的條帶，亦有一些非特異擴(kuò)增的產(chǎn)物，而以樣本20的連接產(chǎn)物為模板，反向PCR產(chǎn)物相對較為特異（樣本14對應(yīng)的連接產(chǎn)物的反向PCR結(jié)果未顯示）。特別是以基因組DNA酶切產(chǎn)物的連接產(chǎn)物為模板，只擴(kuò)增出DHN1-L的側(cè)翼序列，而DHN1-S的側(cè)翼序列沒有被擴(kuò)增出來。這可能是因?yàn)榛蚪MDNA酶切產(chǎn)物的連接產(chǎn)物比較復(fù)雜，以其為模板進(jìn)行反向PCR時(shí)，所用反向PCR引物與多個(gè)模板競爭所致（圖3）。

對樣本14和樣本20的反向PCR產(chǎn)物克隆測序。結(jié)果表明，2者的側(cè)翼序列高度同源，但DHN1-S的側(cè)翼序列與DHN1-L的側(cè)翼序列相比有3處缺失（圖4-A）。DHN1-S，DHN1-L及其側(cè)翼序列已拼接并上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫，登陸號分別為EF371881和EF371882。與已公布葡萄全基因組序列比對發(fā)現(xiàn)[8]，2者位于第4號染色體同一座位，為等位基因。EF371882與已公布葡萄全基因組對應(yīng)序列同源性相對較高，為99.5%；EF371881與葡萄全基因組序列對應(yīng)序列同源性相對較低，為97.2%，并且存在DNA片段缺失。由于2個(gè)Hind III酶切位點(diǎn)分別位于脫水素基因的5’UTR和下游基因間隔區(qū)，因此反向PCR方法僅獲得了脫水素基因下游序列，未能獲得啟動子區(qū)序列（圖4-A）。

2.4 脫水素等位基因所翻譯蛋白的生物信息學(xué)分析

通過與已知脫水素基因DNA序列（NCBI登錄號：AY706987，AY706988，AY706989，AY706990）同源性比對，發(fā)現(xiàn)所克隆序列EF371881和EF371882含有完整的編碼區(qū)（圖4-A）。序列EF371882由2個(gè)外顯子組成，位置分別為151-354和439-627，所翻譯蛋白命名為DHN1a。序列EF371882的2個(gè)外顯子位置分別為82-267和356-544，所翻譯蛋白命名為DHN1b。2個(gè)基因序列的編碼區(qū)相比，序列EF371881的編碼區(qū)在第1個(gè)外顯子區(qū)缺失18 bp DNA片段（圖4-A），導(dǎo)致所翻譯蛋白DHN1b缺失6個(gè)氨基酸（圖4-B）。疏水性分析表明，DHN1a和DHN1b均具有較強(qiáng)的親水性（圖4-C，4-D）。因?yàn)槿笔У?個(gè)氨基酸具有較強(qiáng)的疏水性，因此在氨基酸缺失部位這2個(gè)脫水素的疏水性有差異（圖4-C，4-D）。三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析表明，DHN1a和DHN1b三級結(jié)構(gòu)都比較舒展，主要由無規(guī)則卷曲和線性結(jié)構(gòu)組成（圖4-C，4-D）。舒展的三級結(jié)構(gòu)能夠保證脫水素具有較大的親水表面[14-16]，這與其抗脫水脅迫的功能相一致[2，4，6]。DHN1a和DHN1b的三級結(jié)構(gòu)之間有一定差異，主要體現(xiàn)在兩處無規(guī)則卷曲區(qū)域（圖4-C，4-D）。DHN1a和DHN1b疏水性和三級結(jié)構(gòu)的差異是否會影響其在抗逆脅迫過程中的功能差異，還需要進(jìn)一步探索。

3 討 論

不同葡萄品種等位基因的序列差異及等位基因的差異表達(dá)，有可能導(dǎo)致不同葡萄品種間的某些性狀（如果實(shí)品質(zhì)，植株抗逆性等方面）發(fā)生改變[8]。脫水素是一種植物胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白[17-19]，其屬于親水蛋白，在干旱、高鹽及冰凍等脫水條件下發(fā)揮重要的功能。本研究發(fā)現(xiàn)，在無核白葡萄基因組中，2個(gè)脫水素等位基因之間序列有差異。進(jìn)而導(dǎo)致所翻譯蛋白（DHN1a和DHN1b）氨基酸序列的差異。疏水性分析發(fā)現(xiàn)，DHN1a和DHN1b具有較高的親水性。由于DHN1a相比于DHN1b多出6個(gè)氨基酸，從而導(dǎo)致2個(gè)蛋白在對應(yīng)區(qū)域親水性有差異。蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，DHN1a和DHN1b構(gòu)象疏松，有利于脫水素蛋白的親水特性。但2者三級結(jié)構(gòu)不完全相同。親水性及高級結(jié)構(gòu)的差異是否會導(dǎo)致DHN1a和DHN1b在蛋白質(zhì)功能方面的差異目前尚不清楚。已有研究證實(shí)，2個(gè)不同形式的脫水素基因在河岸葡萄和霞多麗葡萄中有明顯的表達(dá)差異，具體表現(xiàn)為河岸葡萄只表達(dá)脫水素基因2個(gè)等位基因中的一個(gè)，而歐洲葡萄同時(shí)表達(dá)這2個(gè)等位基因[11]。而且這2個(gè)材料的抗性差異明顯，河岸葡萄具有較強(qiáng)的抗寒性和抗病性，而霞多麗葡萄抗寒性和抗病性均較差[20-21]，但是歐洲葡萄的抗旱性強(qiáng)于河岸葡萄[22]。脫水素基因不同等位基因在抗逆過程中的功能差異還需進(jìn)一步探索。

本研究表明，Southern雜交結(jié)合基于瓊脂糖凝膠梯狀回收的方法能夠用于脫水素不同等位基因的克隆，該研究策略簡便實(shí)用，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。Southern雜交是最常用的檢測等位基因數(shù)量的方法，該方法原理簡單，結(jié)果直觀，但是該方法只能檢測到等位基因的數(shù)目，無法獲得等位基因的序列信息。我們的方法結(jié)合反向PCR可以獲得這些基因的側(cè)翼序列。為進(jìn)一步分析無核白脫水素等位基因功能差異提供了依據(jù)。該研究策略除可用于克隆和分析基因的不同拷貝、等位基因變異之外，亦可以用于轉(zhuǎn)基因生物中外源基因在基因組的插入位點(diǎn)分析。轉(zhuǎn)基因生物中外源基因有一個(gè)或多個(gè)拷貝，即外源基因在基因組中有一個(gè)或多個(gè)插入位點(diǎn)。首先，通過Southern雜交（采用多個(gè)平行限制性內(nèi)切酶或內(nèi)切酶組合充分酶解基因組DNA）分析轉(zhuǎn)基因生物外源基因拷貝數(shù)。進(jìn)而，選取能夠清楚分開不同外源基因拷貝的限制性內(nèi)切酶（組合）充分酶解轉(zhuǎn)基因生物基因組DNA，通過基于瓊脂糖凝膠梯狀回收的方法回收不同凝膠塊的酶切產(chǎn)物。最后根據(jù)外源基因序列設(shè)計(jì)反向PCR引物，進(jìn)行反向PCR擴(kuò)增，便可得到外源基因不同拷貝在轉(zhuǎn)基因生物中的插入位點(diǎn)信息。根據(jù)這些數(shù)據(jù)，便可判斷外源基因在轉(zhuǎn)基因生物中的插入位點(diǎn)是在常染色質(zhì)區(qū)還是異染色質(zhì)區(qū)；外源基因的插入是否導(dǎo)致生物本身內(nèi)源基因失活等信息。

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